豬精液冷凍效果評價

豬精液冷凍效果評價

人工飼養(yǎng)（ai）對于動物育種的發(fā)展非常重要，但人工屠宰技術(shù)的普及取決于精子的長期保存。與其他動物(如牛)相比,豬人工授精發(fā)展的速度緩慢。其主要原因是精液冷凍技術(shù)不過關(guān),精液不能長期保存。盡管自20世紀70年代以來,豬的凍精人工授精已經(jīng)取得重要進展,妊娠率和窩產(chǎn)仔數(shù)都已接近養(yǎng)豬戶所能接受的水平,但仍存在著冷凍操作程序復(fù)雜、受胎率低以及效果不穩(wěn)定等問題。為進一步改進豬精液冷凍方法,提高凍配受胎率,本試驗以解凍后的精子活率、活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和人工授精結(jié)果為判定指標,比較了幾種冷凍稀釋液、解凍液及冷凍-解凍程序?qū)ωi精液冷凍的效果,篩選出了最佳的冷凍稀釋液、解凍液和冷凍-解凍程序,并對所篩選出的稀釋液和冷凍程序做了改進。1材料和方法1.1收集精子采用手握法自3頭繁殖歷史清楚、平均年齡在2.5歲的哈白公豬采集精液,收集精子豐富部分,經(jīng)紗布濾過去除膠體。采精后立即檢查精液量、精子活力和密度,并在37℃下于0.5h內(nèi)運抵實驗室。1.2溶液稀釋1.2.1稀釋液的配制共選用4種冷凍稀釋液,其中Ⅰ號冷凍稀釋液參照淵錫藩等、Ⅱ號參照Hammitt等、Ⅲ號和Ⅳ號參照Cordova等的配方配制。具體成分見表1。1.2.2精子密度的測定Ⅰ號稀釋液的稀釋程序:精液在室溫(20℃左右)下靜止1h后,分裝到離心管內(nèi)(每管精子總數(shù)約3×1010個,共10mL),300×g離心10min。然后去除上清,用稀釋液稀釋到5mL并分裝到小瓶中。將稀釋后的精液在5℃冰箱內(nèi),水浴冷卻2h左右,使溫度降至8℃。檢查精子活力,取活力在60%以上的精液直接進行冷凍。Ⅱ號稀釋液的稀釋程序:首先,將精液用稀釋液的第1液1∶1稀釋。接著,在室溫下靜置2h后,再在15℃水浴槽中靜置2h。然后取出,300×g離心10min。而后,按1∶1的比例將稀釋液的第2液加入到已析出精清的精液中,并放入5℃冰箱中水浴靜置1h。接著,再按1∶1的比例加入稀釋液的第3液,最終精子密度為6×108個/mL。最后,在5℃冰箱中平衡15min后,檢查精子活力,取活力在60%以上的進行冷凍。Ⅲ號稀釋液的稀釋程序:用稀釋液的第1液以1∶1稀釋后,在室溫下靜置2h。接著,在15℃水浴槽中靜置2h,取出,300×g離心10min。然后,按2∶1的比例將1mL稀釋液的第2液加入2mL離心后去除精清的精液中,用小瓶裝好,放入5℃冰箱中水浴靜置1h。最后,再添加1mL第2液,放入5℃冰箱中水浴靜置1h。檢查,取精子活力在60%以上的冷凍。Ⅳ號稀釋液的稀釋程序:取含有1.4×109個精子的精液,300×g離心10min,去除精清。在室溫下用第1液將沉淀物稀釋到4.5mL。所獲得的精子懸液在5℃下水浴保存1.5h。然后,加入0.25mL5℃的第2液,并在5℃下水浴停留5min。接著,再加入同樣量的5℃的第2液,并在5℃下水浴平衡3h。取活力在60%以上精液進行冷凍。1.3冷和冷1.3.1液參照配方共用了4種解凍液。其中Ⅰ號解凍液(BTS液)參照郭年藩、Ⅱ號參照Cordova等、Ⅲ號參照Winston等、Ⅳ號參照Hammitt等的配方配制。具體成分見表2。1.3.2液注和解凍方法向廣口冷凍容器內(nèi)注入2/3左右的液氮,在距液氮面上方3~5cm處懸放一冷凍銅網(wǎng)。冷卻平衡大約10min后,將稀釋好的精液滴注在銅網(wǎng)上,每滴大約0.1mL。迅速均勻滴注,不超過30滴。滴好后,蓋上蓋再凍10min。最后,將顆粒鏟下投入液氮中保存。采用濕解凍法,用試管盛一定量解凍液,40℃水浴。然后,從液氮罐中取出顆粒在空氣中停留20s后投入解凍液中,快速振蕩試管使之融化。1.3.3在支架上溶解“細管”取細管支架放到液氮面以上5cm處,蓋上容器蓋平衡10min。用0.5mL的聚乙烯細管裝好平衡好的精液并封口。然后,將細管水平擺好放在支架上,蓋好容器蓋。在液氮面上熏蒸10min,迅速將細管裝入提簍并放入液氮中保存。解凍時,取500mL的大燒杯,倒入39℃溫水。在空氣中停留20s后,將細管置溫水中并迅速攪動。待精液完全溶解時,馬上取出細管,剪開兩端,將精液與預(yù)熱的39℃解凍液混合。試驗中,除了比較不同解凍液的解凍效果外,其余各項試驗均采用Ⅳ號解凍液解凍。1.4液體質(zhì)量測試1.4.1下孵育取50μL精液放1mL孵育液中,在37℃下孵育20min。然后,取20μL滴在保溫37℃的血細胞計數(shù)板上,蓋上蓋玻片,在40倍相差顯微鏡下觀察并計算精子活力。1.4.2熒光顯微觀察用活體熒光染料Hoechst33258-CTC聯(lián)合染色。取出50μL精液用1mL孵育液稀釋后,在37℃下孵育20min。然后,取396μL精子懸浮液,加入4μLHoechst33258染液?；靹?避光室溫染色3min。在1.5mL離心管中放入1mL3%的PVP溶液,再把染色精液輕輕鋪在PVP溶液上,500×g離心6min,去上清。沉淀精子用50μLmBO液懸浮均勻。取45μL精子懸液加入45μL的CTC染液,混勻。然后,再加入8μL12.5%的多聚甲醛溶液,混勻。取10μL精子懸液,加入等量增光劑,混勻后蓋上蓋片,用無色指甲油封片,避光保存并盡快用熒光顯微鏡觀察。為Hoechst33258著色的死精子在波長330~380nm、輻射波長420nm的紫外光激發(fā)下核區(qū)發(fā)綠光,活精子核區(qū)不發(fā)光。CTC熒光染料能著色精子頂體,在激發(fā)波長400~440nm、輻射波長470nm的紫外光下精子的頂體發(fā)出黃綠光,以此區(qū)分頂體完整和不完整的精子。每次檢測,用血細胞計數(shù)器計數(shù)200個精子,計算精子活率和頂體完整率。1.4.3濃度采用低滲腫脹法。取50μL精液放入1mL低滲液(37℃)中,混勻。30min后,取出20μL滴在血細胞計數(shù)板上,40倍相差顯微鏡下觀察5個視野,每次檢測至少數(shù)200個精子,計算彎尾精子的百分率。1.5受精液的健康經(jīng)產(chǎn)豬采用選出的最佳稀釋液、稀釋程序、解凍液和解凍程序所制備的精液給健康經(jīng)產(chǎn)母豬輸精。輸精劑量為20mL,活精子數(shù)在30億以上。每頭母豬輸精2次,第1次輸精在發(fā)情開始后的12~14h,第2次輸精在第2天的早晨(5:00)。1.6處理數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS軟件的MEANS和GLS過程對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。2結(jié)果2.1不同的稀釋液對精子活力、活率和頂體完整率和彎尾率的影響見表3。Ⅰ號、Ⅱ號和Ⅲ號稀釋液的彎尾率和頂體完整率差異不顯著。但Ⅲ號稀釋液的活率顯著高于Ⅰ、Ⅱ號稀釋液。Ⅰ號稀釋液的活力顯著低于Ⅱ號、Ⅲ號稀釋液。Ⅳ號稀釋液冷凍解凍后的精子活力、活率、頂體完整率和彎尾率均顯著高于前3種稀釋液(P<0.05)。這說明用Ⅳ號稀釋液進行冷凍對精子頂體、質(zhì)膜的損傷比較小,可以使精子保持較高的活力和活率。因此,以下的試驗均采用Ⅳ號稀釋液作為基礎(chǔ)稀釋液進行冷凍。2.2o.e.p在Ⅳ號稀釋液原有成分不變的情況下,添加0.1%、0.5%、1.0%、2.0%的O.E.P。結(jié)果(表4)表明,添加O.E.P對精子活力的影響不明顯,但添加0.5%、1.0%和2.0%的O.E.P卻能使精子的活率提高5%、彎尾率提高6%、頂體完整率提高接近10%,與對照組差異顯著(P<0.05)。2.3冷凍效果的比較應(yīng)用改進的稀釋液(Ⅳ液加1%O.E.P)比較了細管法和顆粒法的冷凍效果。結(jié)果(表5),細管法比顆粒法活率提高近7個百分點(P<0.05),活力提高6個百分點(P<0.05)。2.4溫度對測定的影響將鮮精液用等溫的Ⅲ號稀釋液第1液以1∶1的比例稀釋后,置于盛有39℃溫水的大容器中水浴室溫(20℃)下分別降溫(預(yù)平衡)2、4、6h。降溫完成后,用Ⅳ稀釋液和稀釋程序進行細管法冷凍。從表6可以看出,降溫4h的精子活力和活率都比對照組(0h)有顯著提高(P<0.05),而降溫0、2、6h的精子活力和活率差異不顯著(P>0.05)。2.5解凍效果的測定用改進的Ⅳ稀釋液和細管法冷凍,解凍溫度為39℃,以活力作為檢測指標,比較了4種解凍液的解凍效果。結(jié)果,應(yīng)用Ⅲ號解凍液解凍后精子活力(42.9±2.6)%顯著高于其他3種解凍液(P<0.05)。Ⅰ號解凍液和Ⅱ號解凍液活力分別為(38.2±0.5)%和(39.5±5.7)%,兩者差異不顯著,但顯著高于Ⅳ號解凍液(36.2±6.1)%(P<0.05)。2.6解凍解凍系統(tǒng)用Ⅳ號稀釋液、細管法冷凍,以Ⅲ號解凍液分別在39℃、50℃和70℃下解凍。結(jié)果用50℃水浴解凍精子的活力(46.3±2.6)%顯著高于39℃水浴(42.9±2.6)%和70℃水浴(41.1±5.7)%解凍的精子。2.7精清和解凍液解凍前后精子活力、活率、彎尾率和頂體完整率的比較表7用Ⅳ號稀釋液、細管法冷凍,以過濾和冷凍獲得精清及Ⅲ號解凍液在39℃下解凍。結(jié)果(表7),精清和Ⅲ解凍液解凍后的精子活力、活率、彎尾率和頂體完整率差異均不顯著(P>0.05)。用2種方法獲得的精清解凍后的活率、活力、彎尾率及頂體完整率等指標差異均不顯著(P>0.05),但過濾法精清解凍后的頂體完整率比冷凍法精清的高1~2個百分點。2.8b解凍液濃度用Ⅳ號稀釋液添加1%O.E.P,預(yù)平衡4h,以Ⅲ號解凍液50℃解凍的精液(活力46%左右)給6頭經(jīng)產(chǎn)母豬輸精,均妊娠產(chǎn)仔,平均每窩產(chǎn)仔9頭。最少的產(chǎn)仔7頭,最多的產(chǎn)11頭,接近本交水平。有3頭母豬產(chǎn)下1~2個弱仔。3不同冷凍劑對冷凍豬權(quán)力機液精子活力和活率的影響通常,對冷凍精液質(zhì)量的檢查往往只看精子活力,活力高就認為效果好。然而,頂體受到損傷的精子即使活力高也可能已喪失了受精能力。例如,精液中頂體畸形率高的公豬,往往不育或受精力低。因而,在進行凍精質(zhì)量評價時,有必要檢測凍后精子頂體的損傷情況。精子質(zhì)膜的完整性也是影響冷凍精液受胎率的一個重要因素。目前,多通過精子經(jīng)低滲處理后的彎尾能力來檢測質(zhì)膜完整性。已經(jīng)證明,精子的低滲彎尾率與獲能率、穿卵率和精子活力相關(guān)顯著。在本試驗中,精子的彎尾率與精子活率之間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性,但與精子活力之間的相關(guān)性不明顯。本試驗比較了目前常用的幾種豬精液冷凍稀釋液的冷凍效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ⅳ號冷凍稀釋液冷凍精子的活力、活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整性最高。與其他3種稀釋液相比,Ⅳ號稀釋液中含有Tris。Tris是一種良好的緩沖物質(zhì),可以使稀釋液pH穩(wěn)定。這可能是保持精子活力的一個重要方面。O.E.P是較常用的凍精稀釋液添加劑,它能增加解凍后頂體完整率。本試驗證明,添加適量O.E.P可使精子活率和彎尾率,特別是頂體完整率有明顯的提高。關(guān)于O.E.P的作用機理,目前尚不完全清楚。某些結(jié)果表明,它可能是通過改變卵黃的成分而起作用,并非直接作用于精子質(zhì)膜。目前,常用的顆粒法和細管法各具優(yōu)缺點,但細管法較受歡迎,它不僅解凍后精子活力較顆粒法高,而且易操作和衛(wèi)生。本試驗中,細管法冷凍豬精液的精子活力比顆粒法提高6個百分點。在冷凍之前緩慢降溫有利于提高精子對低溫的耐受性。在室溫下將精液靜止一段時間可使解凍后精子活力有顯著提高,但降溫的具體時間未見報道。從本試驗結(jié)果看,預(yù)降溫時間過長或過短對精子活力和活率的提高都不利。降溫4h,精子解凍后活力和活率都顯著高于降溫0、2、6h。直接在一種溶液中解凍比在干燥試管中解凍效果為好。常用的解凍液可分為2類:第1類僅由鹽類組成,第2類加有蛋白質(zhì)。解凍液僅維持生理滲透壓