中藥蓮子心中3種酚性生物堿的含量測(cè)定

中藥蓮子心中3種酚性生物堿的含量測(cè)定

蓮花是睡蓮科植物的成熟種子。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》記載其性苦、寒,歸心、腎經(jīng),具有清心安神、交通心腎、澀精止血之功效,用于治療熱入心包、神昏譫語(yǔ)、心腎不交、失眠遺精及血熱吐血等癥。蓮子心成分主要分為酚性和非酚性生物堿兩大類(lèi),其中蓮心堿(liensinine,Lien)、異蓮心堿(isoliensinine,Iso)和甲基蓮心堿(neferine,Nef)等酚性生物堿是目前公認(rèn)的蓮子心中主要有效成分,具有廣泛的抗心律失常作用;近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)蓮子心酚性生物堿具有改善胰島素抵抗、治療糖尿病的作用。關(guān)于對(duì)蓮子心中酚性生物堿的含量測(cè)定,特別是用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時(shí)對(duì)Lien、Iso和Nef進(jìn)行定量分析的報(bào)道已有很多。熒光檢測(cè)器(fluorescencedetector,FD)也是高效液相色譜儀常用的一種檢測(cè)器。蓮子心中酚性生物堿Lien、Iso和Nef具有雙芐基異喹啉結(jié)構(gòu),屬于多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì),在紫外燈下能產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光,而對(duì)它們進(jìn)行定量分析的HPLC-FD法國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了專(zhuān)屬的反相離子對(duì)HPLC-FD法,對(duì)湖南、江西和福建等產(chǎn)地的蓮子心中3種酚性生物堿進(jìn)行測(cè)定,并與HPLC-UVD法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果報(bào)道如下。1材料表面1.1儀器、試劑與儀器島津高效液相色譜儀(日本Shimadzu制作所),包括LC-10AD泵、SPD-10A紫外檢測(cè)器和RF-10A熒光檢測(cè)器;AUTOSCIENCEAT-130柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);外置式(CT-21型)HW-2000色譜工作站(上海千譜軟件有限公司);島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本Shimadzu制作所);METTLERAE-240電子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),最大功率:500W;SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器(金壇市國(guó)勝儀器廠);高速中藥粉碎機(jī)(武義縣屹立工具有限公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)。1.2uv、ir、1hnmr、13cnmr及ms的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)對(duì)照品蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿均從中藥蓮子心中提取、分離獲得,經(jīng)UV、IR、1HNMR、13CNMR、2DNMR和MS確定它們的化學(xué)結(jié)構(gòu),HPLC-UVD歸一化法分析三者的純度均達(dá)95%以上;乙腈為HPLC專(zhuān)用試劑,十二烷基磺酸鈉、鹽酸、冰醋酸和甲醇均為分析純,水為重蒸餾水。1.3藥用菌鑒定及藥物鑒定3批蓮子心藥材分別來(lái)源于我國(guó)湖南、福建和江西省,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所潘揚(yáng)研究員鑒定均為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn成熟種子的干燥幼葉及胚根。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)定Lien4.78mg、Iso3.94mg和Nef4.83mg,置5mL量瓶中,加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度,作為各對(duì)照品儲(chǔ)備液,4℃下冷藏。2.2熒光峰與em、em的掃描結(jié)果取用流動(dòng)相稀釋至一定程度的Lien、Iso和Nef對(duì)照品溶液,分別在熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。首先,設(shè)定2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)(λEX),分別進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)(λEM)模式下掃描,顯示上述3種對(duì)照品溶液2次掃描所得λEM均在319nm左右相同位置處位移很少,因此認(rèn)定其為熒光峰。然后,以319nm為發(fā)射波長(zhǎng),進(jìn)行λEX模式下掃描,發(fā)現(xiàn)在233nm與280nm2處出現(xiàn)了吸收峰。但當(dāng)λEX為233nm時(shí),在319nm處甲醇溶劑的吸收也相當(dāng)強(qiáng);λEX為280nm時(shí),甲醇溶劑幾乎無(wú)吸收,最后確定熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為:λEX=280nm,λEM=319nm(圖1)。2.3減失劑的制備取蓮子心(粉碎,過(guò)4號(hào)篩)0.5g,精密稱(chēng)定,精密加入2%鹽酸甲醇溶液25mL,稱(chēng)定質(zhì)量,加熱回流30min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用2%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5mL,置10mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋到刻度,搖勻,0.45μm濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液進(jìn)樣。2.4流動(dòng)相、熒光分離器色譜柱:Hedraue84aSymbolTC@ODS-2C18柱(5μm,4.6mm×250mm)江蘇漢邦科技有限公司,批號(hào):H1810405.25;流動(dòng)相:乙腈-.015mol/L十二烷基磺酸鈉(取十二烷基磺酸鈉0.408g,加水100mL使溶解)-醋酸(55∶5∶1);流速:1.0mL/min;柱溫:30℃。熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)280nm,發(fā)射波長(zhǎng)319nm;紫外檢測(cè)器:282nm,進(jìn)樣量:20μL。在此色譜條件下測(cè)定,理論塔板數(shù)按蓮心堿計(jì)應(yīng)不低于5000,各相鄰色譜峰達(dá)到基線分離(見(jiàn)圖2)。2.5流動(dòng)相的稀釋分別量取“2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液20、50、80、110、140、170、200、230μL,置于5mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,進(jìn)樣20μL。分別以Lien、Iso和Nef的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(C),色譜峰的面積值(mV)為縱坐標(biāo)(A),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)表1。2.6進(jìn)樣的測(cè)定和重現(xiàn)性測(cè)定精密吸取同一樣品溶液,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量:20μL。記錄Lien、Iso和Nef色譜峰的面積值(mV),并計(jì)算它們的RSD(%)。Lien、Iso和Nef的計(jì)算結(jié)果:RSD(%)分別為4.05、3.06和3.83,表明進(jìn)樣精密度良好。取蓮子心(粉碎,過(guò)4號(hào)篩)0.5g,平行5份,精密稱(chēng)定,照“2.3”項(xiàng)下方法制備,精密吸取樣品溶液20μL進(jìn)樣,測(cè)定樣品中Lien、Iso和Nef的平均含量(%),并計(jì)算它們的RSD(%)。Lien、Iso和Nef的計(jì)算結(jié)果:平均含量(%)分別為0.095、0.114和0.392;RSD(%)分別為4.16、1.43和2.53,表明測(cè)定重現(xiàn)性良好。精密吸取同1樣品溶液,在0h、4h、8h、14h、20h、32h、48h時(shí)各測(cè)定一次,進(jìn)樣量:20μL。記錄48h內(nèi)Lien、Iso和Nef的峰面積值(mV),分別計(jì)算它們的RSD(%)。Lien、Iso和Nef計(jì)算結(jié)果:RSD(%)分別為4.27、2.47和1.15,表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.7樣品溶液的制備分別取已知含量的樣品粉末0.4g、0.3g和0.2g,精密稱(chēng)定,平行2份,各精密加入3個(gè)不同水平(1∶2∶3)的Lien、Iso和Nef對(duì)照品溶液,照“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,注入高效液相色譜儀,進(jìn)樣量:20μL。測(cè)定并計(jì)算Lien、Iso和Nef加樣回收率(%)及RSD(%),結(jié)果見(jiàn)表2。2.8紫外法檢測(cè)樣品中l(wèi)ien、iso和nf、uvd分別取蓮子心樣品,照“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,分別以熒光檢測(cè)器(FD)和紫外檢測(cè)器(UVD)進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣量:20μL,并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中Lien(C37H42N2O6)、Iso(C37H42N2O6)和Nef(C38H44N2O6)的含量(%),結(jié)果見(jiàn)表3。3檢測(cè)結(jié)果及方法學(xué)驗(yàn)證由于蓮子心中3種酚性生物堿結(jié)構(gòu)相似(近),其中蓮心堿、異蓮心堿互為同分異構(gòu)體,三者熒光光譜的特性(激發(fā)光譜和熒光光譜)也基本類(lèi)同,因此可采用統(tǒng)一的測(cè)定波長(zhǎng)進(jìn)行HPLC-FD法進(jìn)行測(cè)定。本研究確定的激發(fā)光譜(280nm)和熒光光譜(319nm)完全符合斯托克斯發(fā)現(xiàn)的熒光定律,即發(fā)光物質(zhì)因吸收電磁輻射(X射線、紫外光、可見(jiàn)光等)而發(fā)射熒光時(shí),熒光的波長(zhǎng)總是較所吸收輻射的波長(zhǎng)為長(zhǎng)(或相同)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,相同濃度異蓮心堿的熒光強(qiáng)度(峰高或峰面積)明顯大于蓮心堿和甲基蓮心堿的熒光強(qiáng)度。通過(guò)對(duì)湖南、福建