無酶標(biāo)記h-igg電流型免疫傳感器的研究

無酶標(biāo)記h-igg電流型免疫傳感器的研究

免疫傳感器是一種結(jié)合高靈敏傳感器和高靈敏傳感器的新生物傳感器。它被用來分析和研究痕跡免疫原因。在各種免疫傳感器的研究中，由于其高靈敏度和簡單的設(shè)備，許多國內(nèi)外科學(xué)家對其感興趣。然而，由于它們的高靈敏度和簡單設(shè)備，它們通常需要酶標(biāo)記抗感染或轉(zhuǎn)化信號，提高傳感器的檢測靈敏度。該傳感器有以下缺點：一些特殊的酶標(biāo)記很難獲得。需要一個電子媒體。檢測過程中的加工方法相對復(fù)雜。因此，基于新技術(shù)、低標(biāo)記或電子手段的革命性免疫傳感器，以及快速、靈敏的檢測方法，對醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測具有重要意義。近年來，一些中國科學(xué)家在不到應(yīng)用標(biāo)記或不到電子手段的情況下對沒有酶標(biāo)記或電子手段的電流免疫傳感器進(jìn)行了一些研究。例如，西南大學(xué)袁若群在電沉積物、電聚合和層壓結(jié)構(gòu)上制作了一系列無酶免疫傳感器。該免疫傳感器是一種無酶免疫傳感器，需要專門的電子顯微鏡技術(shù)和電子顯微鏡。大學(xué)蔡培祥教授將實驗與金融石縮技術(shù)相結(jié)合，檢測乙肝蛋白酸鈉。上述研究簡化了檢測步驟，但存在電子媒體泄漏、抗性固定量低、無酶指數(shù)、靈敏度和穩(wěn)定性等問題。此外，目前的利率免疫傳感器主要是通過檢測生物體和抗逆反應(yīng)前后電極上的循環(huán)伏安電流或即時電流來達(dá)到檢測目標(biāo)的新方法。然而，關(guān)于不規(guī)則脈沖伏安免疫傳感器的研究很少。對于不規(guī)則脈沖伏安免疫傳感器沒有報道，關(guān)于不規(guī)則脈沖伏安免疫傳感器的研究很少。本文采用自組裝技術(shù),以一種容易獲得、可在金電極表面自主裝的L-半胱氨酸化合物為基底結(jié)合Nano-Au,并固定羊抗人免疫球蛋白抗體(anti-h-IgG),利用差分脈沖伏安法檢測免疫反應(yīng)前后L-半胱氨酸對多巴胺催化電流的變化,制備了無酶標(biāo)記且無電子媒介體的h-IgG電流型免疫傳感器.其創(chuàng)新點如下:①該傳感器制備及反應(yīng)過程中沒引入電子媒介體,故無電子媒介體滲漏、富集等不良問題,進(jìn)一步提高了電極穩(wěn)定性;②該電極在反應(yīng)過程中沒引入酶,而是利用L-半胱氨酸對多巴胺很強的直接電催化作用放大電信號,因此抗體占據(jù)了電極上幾乎所有的活性位點,增大抗原與抗體結(jié)合的機會;③通過Nano-Au固定在電極上的抗體可以保持良好的生物活性,從而提高了電極的靈敏度;④每次免疫反應(yīng)發(fā)生后,電極轉(zhuǎn)入含多巴胺的PBS溶液中用差分脈沖伏安法測定電流變化,避免了樣品中干擾物的干擾.1實驗部分1.1氨基酸l-半胱氨酸羊抗人IgG抗體(anti-h-IgG,上海生物制品研究所,效價1∶140),人血漿免疫球蛋白(h-IgG,成都生物制品研究所);L-半胱氨酸(上?？颠_(dá)氨基酸試劑廠);牛血清白蛋白(BSA)、多巴胺(Sigma公司);其余試劑均為分析純,購自四川化學(xué)試劑廠.實驗用水為二次蒸餾水.CHI660A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司).三電極系統(tǒng):anti-h-IgG抗體修飾電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為對電極,以含0.35mmol/L多巴胺的0.25mol/LPBS溶液(pH=6.5)為測試底液.1.2納米金設(shè)備納米金(Nano-Au)的制備參照文獻(xiàn).1.3nano-au/4.2戊二醛/3.5%戊二醛電極的制備將經(jīng)過預(yù)處理的金電極(?=4.0mm)插入20mmol/LL-半胱氨酸(pH=6.5)溶液中浸泡2h后,分別在Nano-Au(4℃,4h)或1%戊二醛(常溫1h)溶液中浸泡,然后將電極浸泡在anti-h-IgG溶液中(4℃,1.5h),最后以1%BSA封閉電極上非特異性結(jié)合位點,取出,水洗后置于4℃冰箱中保存待用.1.4dpv的測定除非特殊說明,每次檢測前,電極在0.25mol/LPBS(pH=6.5)含不同抗原濃度的溶液中孵育10min,然后轉(zhuǎn)入含0.35mmol/L多巴胺的PBS(pH=6.5)溶液中,利用DPV檢測其電流變化,然后以ΔI=I0-I計算,其中,I0代表修飾電極與抗原反應(yīng)前在測試底液中的電流,I代表修飾電極與待測抗原反應(yīng)后在測試底液中的電流.2結(jié)果與討論2.1修飾電極的穩(wěn)定性以不同修飾狀態(tài)的電極為工作電極,于含0.35mmol/L多巴胺的0.25mol/LPBS(pH=6.5)測試底液中,在-0.2～0.6V范圍內(nèi)進(jìn)行DPV測定,所得DPV曲線如圖1所示.圖1曲線a是L-半胱氨酸修飾裸金電極后的DPV曲線,可見有一明顯的峰電流曲線,這是因為L-半胱氨酸對多巴胺有強的催化作用.當(dāng)該L-半胱氨酸電極吸附Nano-Au后,峰電流值增大(圖1曲線b),這是因為納米金具有導(dǎo)電性,能促進(jìn)電子的傳遞.Nano-Au組裝了無電活性的anti-h-IgG后,因為anti-h-IgG占據(jù)并堵塞了部分孔徑通道,使多巴胺向L-半胱氨酸及Nano-Au擴散的有效表面積減小,阻礙了L-半胱氨酸對多巴胺的催化,也降低Nano-Au的導(dǎo)電性能,從而使峰電流值減小(圖1曲線c),這是當(dāng)用BSA封閉電極上非特異性結(jié)合位點后,峰電流值進(jìn)一步減小(圖1曲線d).該修飾好的免疫電極在20ng/mL的h-IgG溶液中培育10min后于測試底液中得到的DPV曲線(圖1曲線e),由于h-IgG與anti-h-IgG的專一性免疫反應(yīng),生成的復(fù)合物堵塞了更多的孔徑通道,使多巴胺向L-半胱氨酸擴散的有效表面積再減小,再次阻礙了L-半胱氨酸對多巴胺的催化,從而使響應(yīng)電流進(jìn)一步下降,即Ie<Id.交流阻抗譜圖進(jìn)一步證明anti-h-IgG在金電極表面的固定.圖2是不同修飾狀態(tài)的電極在Fe(CN)64-/3-溶液中的交流阻抗譜圖.從圖可以看出,隨著電極表面的逐層修飾,阻抗隨之發(fā)生變化,并且半圓的直徑約為電子傳遞的阻抗(Ret).當(dāng)裸金電極被L-半胱氨酸修飾后,出現(xiàn)了高頻Ret阻抗(250兆)(圖2a),當(dāng)L-半胱氨酸修飾金電極吸附Nano-Au后(圖2b),其交流阻抗略小于L-半胱氨酸的阻抗,原因是納米尺寸的金溶膠有增強電子傳遞的能力.當(dāng)抗體(圖2c)和牛血清白蛋白(圖2d)分別固定在電極上后,堵塞了修飾電極表面更多孔徑通道,致使電極表面擴散的有效截面積進(jìn)一步變小,進(jìn)一步增大了Fe(CN)63-到電極表面參加反應(yīng)的阻力,故膜本體阻抗依次增大,其阻抗均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Nano-Au/L-半胱氨酸/電極.2.2免疫電極的選擇性兩種不同抗體固定方法的免疫響應(yīng)見圖3.由圖可知由戊二醛做交聯(lián)劑固定抗體制備的免疫傳感器(圖3曲線b),電極的電流響應(yīng)比由Nano-Au固定抗體制備的免疫傳感器的電流響應(yīng)低(圖3曲線a),這是因為采用戊二醛共價鍵合固定抗體可能使抗體分子的部分活性位點被鍵合失活,不利于免疫反應(yīng)的進(jìn)行,導(dǎo)致靈敏度低,而Nano-Au能促進(jìn)電子的傳遞,其大的比表面積增加了抗體的固定量,且固定后的抗體能保持良好的生物活性,從而提高了電極的靈敏度.圖4是免疫電極與20ng/mLh-IgG反應(yīng)后,在0.25mol/LPBS(pH=6.5)中不同多巴胺濃度對電流響應(yīng)的影響.由圖可見,當(dāng)多巴胺濃度超過0.35mmol/L,傳感器的電流響應(yīng)不再增加,故0.35mmol/L多巴胺濃度為最佳濃度.圖5為該免疫傳感器對h-IgG的動力學(xué)響應(yīng)曲線.由圖可見,至10min左右,響應(yīng)電流基本達(dá)到平穩(wěn),故實驗過程中選用的最佳培育時間是10min.該免疫電極與20ng/mLh-IgG反應(yīng)后,在0.25mol/LPBS(pH=6.5)中含0.35mmol/L多巴胺的不同pH溶液中測定其電流響應(yīng).實驗結(jié)果表明,在pH=6.5時電流響應(yīng)達(dá)到最大值.故本實驗選擇測試底液的pH為6.5.2.3傳感器的電流響應(yīng)值.在最優(yōu)條件下將該免疫傳感器與不同濃度待測溶液反應(yīng)后,測定其電流響應(yīng)值.實驗結(jié)果表明,該傳感器在0.80～90ng/mL的范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系(圖3a),y=0.0478x+0.4215,R2=0.9966.2.4h-igg重現(xiàn)性檢測抗壞血酸、硝基酚、腎上腺素等對該傳感器的測定均有較大影響,由于每次免疫反應(yīng)發(fā)生后,電極轉(zhuǎn)入無上述干擾物的含多巴胺的PBS中測定,由此避開了h-IgG樣品中的干擾物.取濃度為40ng/mL的4份h-IgG進(jìn)行重現(xiàn)性檢測,相對標(biāo)準(zhǔn)誤差為6.1%.將此傳感器對5份不同濃度的h-IgG樣品進(jìn)行檢測,樣品的回收率為98.6%～103.5%.用鹽酸-氨基酸對傳感器進(jìn)行9次再生后,該傳感器的電流響應(yīng)值仍可保持原電流響應(yīng)值91.0%.3nano-au免疫傳感器以L-半胱氨酸為基底結(jié)合納米金,然后固定抗體,利用L-半胱氨酸對多巴胺的直接電催化作用制備了無酶標(biāo)記且無電子