淀粉內(nèi)標(biāo)dna顯色分光光度計(jì)測(cè)試方法的研究

淀粉內(nèi)標(biāo)dna顯色分光光度計(jì)測(cè)試方法的研究

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物酶在紡織領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是在純棉紡織物的預(yù)處理中。前處理是印染產(chǎn)品加工的基礎(chǔ),在純棉織物的前處理中,果膠是否去除直接影響到棉織物半成品的毛效和質(zhì)量。當(dāng)前生物酶技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用于前處理,棉織物中果膠含量的測(cè)定是判定前處理質(zhì)量好壞和前處理技術(shù)水平的重要指標(biāo)之一。用分光光度計(jì)測(cè)定棉織物中果膠含量的方法通常有2種:3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法和咔唑濃硫酸顯色法。咔唑濃硫酸顯色法應(yīng)用較廣泛,但對(duì)濃硫酸的純度要求較高,且糖分的存在對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大,使測(cè)定結(jié)果明顯偏高。一般DNS顯色法也由于淀粉漿的存在使得果膠含量無(wú)法精確測(cè)定。退漿后再測(cè)定果膠含量,則殘余的淀粉漿和退漿過(guò)程中的洗滌作用會(huì)較大程度地影響測(cè)試精度。本文在DNS顯色分光光度計(jì)法的基礎(chǔ)上,通過(guò)定量測(cè)定果膠萃取液中的淀粉含量,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法獲得其分解產(chǎn)物葡萄糖的量,然后得出對(duì)應(yīng)的顯色吸光度,從而排除殘余淀粉漿對(duì)果膠測(cè)定的影響,得到淀粉內(nèi)標(biāo)DNS顯色分光光度計(jì)法。該方法剔除了淀粉帶來(lái)的影響,從而能夠準(zhǔn)確地測(cè)定棉織物中的果膠含量,對(duì)研究果膠對(duì)棉織物潤(rùn)濕性的影響、復(fù)合酶生物技術(shù)前處理的優(yōu)化等具有重要意義。1實(shí)驗(yàn)1.1紗線密度及紗線密度純淀粉上漿的純棉機(jī)織坯布,經(jīng)、緯密分別為377.5、251.5根/10cm,經(jīng)緯紗線密度均為24.3dtex;3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、苯酚、氫氧化鈉、草酸銨、D-半乳糖醛酸、醋酸、高氯酸、濃硫酸(以上皆為分析純)、果膠、碘、碘化鉀、玉米淀粉、酚酞。1.2顯色液的量淀粉和果膠在濃硫酸加熱回流條件下的分解產(chǎn)物(淀粉分解成葡萄糖、果膠分解成D-半乳糖醛酸)都能還原3,5-二硝基水楊酸而顯色,顯色深度和分解產(chǎn)物的濃度成正比。淀粉、果膠的量分別與其對(duì)應(yīng)的分解產(chǎn)物的量成正比,分解產(chǎn)物的量又與顯色液的吸光度成正比,因而可以吸光度值定量表征分解產(chǎn)物的量。碘顯色法定量測(cè)定果膠萃取液中的淀粉量,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得淀粉分解產(chǎn)物的吸光度,萃取回流液總的吸光度減去淀粉分解產(chǎn)物的吸光度即為果膠分解產(chǎn)物的吸光度,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)應(yīng)獲得果膠含量。1.3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.3.1碘化鉀的測(cè)定方法DNS試劑(6.3g/L):稱取6.3g的3,5-二硝基水楊酸,水浴加熱45℃左右溶解于500mL蒸餾水中,再逐步緩緩加入NaOH21.0g、酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O)182.0g、苯酚5.0g和無(wú)水亞硫酸鈉5.0g,溫水浴(不超過(guò)48℃)中不斷攪拌,直至溶液清澈透明。冷卻后用蒸餾水定容至1000mL,保存在棕色試劑瓶中,放置1周后使用。碘顯色液(2.00g/L):精確稱量1.00g碘,10.00g碘化鉀,先用少量水使碘溶于碘化鉀溶液中,定容至500mL容量瓶中。配制果膠液(5.000g/L)、草酸銨溶液(5.00g/L)、D-半乳糖醛酸溶液(1.000g/L)、淀粉溶液(1.000g/L、20.000g/L)。1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.3.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取1.000g/L的淀粉溶液0.4、1.2、2.4、3.6、4.8、5.6、6.4mL分別置于7個(gè)100mL的容量瓶中,配成質(zhì)量濃度分別為4、12、24、36、48、56、64mg/L的淀粉液,各加入碘顯色液5mL并定容,置于暗處充分顯色5min。另取1支100mL容量瓶,加入碘顯色液5mL定容,作為參比液,在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以淀粉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到如圖1所示標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖1得到回歸方程式中:A為吸光度;C為淀粉質(zhì)量濃度,mg/L。1.3.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取20.000g/L的淀粉溶液10mL于250mL燒瓶中,加入80mL水、10mL濃硫酸,加熱回流1.5h使淀粉充分水解。以酚酞為指示劑,用濃度為6mol/L的NaOH溶液滴定到溶液呈粉紅色,再用濃度為2mol/L的稀醋酸滴定至無(wú)色,定容至1000mL容量瓶中。取DNS試劑5mL于刻度試管中,用蒸餾水定容至25mL作為參比液。用25mL刻度試管9支分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL回流液,5mLDNS試劑和一定量的蒸餾水使總液量保持10mL,在沸水中加熱8min,充分顯色后冷卻定容至25mL,在540nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度,并以淀粉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到如圖2所示標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖2得到回歸方程式中:A為吸光度;C為淀粉質(zhì)量濃度,mg/25mL。1.3.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取質(zhì)量濃度為5.000g/L的果膠溶液50mL于250mL燒瓶中,加入40mL水、10mL濃硫酸,加熱回流1.5h,冷卻后以酚酞為指示劑,用濃度為6mol/L的NaOH溶液滴定到溶液呈粉紅色,再用濃度為2mol/L的稀醋酸滴定到無(wú)色,定容至500mL容量瓶中。取DNS試劑5mL于刻度試管中用蒸餾水定容至25mL作為參比液。分別取回流液1.0、1.3、1.6、1.9、2.2、2.5、2.8、3.1、3.4mL,DNS試劑5mL和一定量蒸餾水于刻度試管中,保持總液量為10mL,在沸水中加熱顯色8min后冷卻,定容至25mL,在540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度,并以果膠質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得到如圖3所示標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖3得到回歸方程式中:A為吸光度;C為果膠質(zhì)量濃度,mg/25mL。1.3.3玻璃棒中和液液制備將充分干燥的布樣(M0=11.065g)剪碎置于500mL燒杯中,按1∶10的質(zhì)量比加入42%的高氯酸溶液,玻璃棒充分?jǐn)嚢杞n30min,以酚酞為指示劑,用濃度為6mol/L的NaOH溶液中和。抽濾并用洗瓶沖洗碎布,保存濾液。將過(guò)濾后的碎布置于500mL的燒瓶中,按1∶20的比例加入0.5%的草酸銨溶液,加熱回流沸煮2h,冷卻,抽濾并用洗瓶沖洗碎布,將2次抽濾液合并,定容于1000mL容量瓶中,搖勻待用。1.3.4濃硫酸回流液制備用移液管移取萃取液50mL于250mL燒瓶中,加入40mL蒸餾水,再在冰水條件下加入10mL濃硫酸,加熱回流1.5h。冷卻后將回流液置于500mL燒杯中,洗滌燒瓶并將洗滌液一塊并入回流液中。滴入1滴酚酞指示劑,用濃度為6mol/L的NaOH溶液滴定至紅色,再用濃度為2mol/L的稀醋酸溶液滴定至無(wú)色,冷卻后定容于500mL容量瓶中。1.3.5測(cè)定了橡膠含量1.3.5.碘顯色液的制備取萃取液5mL于100mL容量瓶中,加入5mL顯色液,定容至100mL,置于暗處?kù)o置顯色5min。取5mL碘顯色液于另一100mL容量瓶中,用蒸餾水定容至100mL作為參比液,在620nm處測(cè)其吸光度。6個(gè)平行樣分別顯色,測(cè)吸光度分別為0.380、0.384、0.381、0.380、0.389、0.378,其平均值A(chǔ)2為0.382。1.3.5.試劑分光浴加熱顯色法取萃取液的硫酸回流液10mL于25mL刻度試管中,加入DNS試劑5mL,沸水浴加熱顯色8min,冷卻后定容至25mL,6個(gè)平行樣分別顯色,測(cè)定吸光度分別為0.575、0.572、0.581、0.569、0.576、0.571,其平均值A(chǔ)1為0.574。2結(jié)果與討論2.1參數(shù)的選擇2.1.1nm以上的吸光度用UV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),以蒸餾水為參比液掃描,測(cè)得DNS試劑(取5mLDNS試劑用蒸餾水定容于25mL刻度試管中)最大吸收波長(zhǎng)為460nm,其在530nm以上的吸光度值接近于0,如圖4所示。以DNS試劑為參比液掃描顯色液(質(zhì)量濃度為1g/L的D-半乳糖醛酸溶液2mL,加入DNS試劑5mL充分顯色,定容至25mL),吸光度曲線(見(jiàn)圖4)表明最大吸收波長(zhǎng)為480nm。一般要求樣品吸收波長(zhǎng)與顯色劑最大吸收波長(zhǎng)之差在60nm以上,其在540nm處的吸光度值為0.437,DNS試劑以蒸餾水為參比在540nm處的吸收值很小,接近于零,因此,以DNS試劑作參比液,可排除過(guò)量DNS試劑的影響,較為準(zhǔn)確地測(cè)得顯色液的吸光度,從而定量表征還原性糖的濃度,故比色測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)選為540nm。2.1.2ds試劑用量對(duì)ds顯色效果的影響DNS試劑的用量對(duì)顯色液吸光度值的測(cè)定有較大影響,因此,既要保證還原性糖的充分顯色,又要避免過(guò)量的DNS試劑對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。對(duì)于一定量的D-半乳糖醛酸溶液(1.000g/L,2mL),分別加入1、2、3、4、5、6、7mLDNS試劑進(jìn)行顯色,顯色液的吸光度隨DNS試劑用量的變化有一定改變,結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可看出,在DNS用量低于3mL時(shí),隨著用量的逐漸增加,顯色液的吸光度明顯提高。繼續(xù)提高DNS試劑的用量,顯色液吸光度提高的幅度明顯減小,達(dá)到5mL之后,繼續(xù)提高DNS試劑的用量,顯色液的吸光度基本保持不變。由此說(shuō)明,DNS試劑的用量為5mL時(shí)可使D-半乳糖醛酸溶液充分顯色。2.1.3ds試劑參比液的制備分別取質(zhì)量濃度為20.000g/L的淀粉溶液10mL于3只250mL燒瓶中,加入80mL水、10mL濃硫酸,分別加熱回流1.0、1.5、2.0h使淀粉水解。冷卻后以酚酞為指示劑,用濃度為6mol/L的NaOH溶液滴定至粉紅色,再用濃度為2mol/L的稀醋酸滴定至無(wú)色,定容至1000mL容量瓶中。取DNS試劑5mL于刻度試管中,用蒸餾水定容至25mL作為參比液。分別取回流液4mL于1、2、3號(hào)刻度試管中,加入DNS試劑5mL,加熱回流8min使其充分顯色,測(cè)其吸光度,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,加熱回流時(shí)間從1.0h延長(zhǎng)到1.5h,顯色液的吸光度值有所提高,但延長(zhǎng)至2.0h時(shí)吸光度值基本不變,說(shuō)明加熱回流時(shí)間1.5h已經(jīng)使淀粉充分水解,故淀粉液硫酸加熱回流時(shí)間為1.5h。2.1.4ds試劑的用量分別取質(zhì)量濃度為5.000g/L的果膠溶液50mL置于3只燒瓶中,加入40mL水、10mL濃硫酸,分別加熱回流1.0、1.5、2.0h,冷卻后以酚酞為指示劑用濃度為6mol/L的NaOH溶液滴定至溶液呈粉紅色,再用濃度為2mol/L的稀醋酸溶液滴定至無(wú)色,定容至500mL容量瓶中。取DNS試劑5mL于刻度試管中,用蒸餾水定容至25mL作為參比液。分別取回流液2mL置于1、2、3號(hào)刻度試管中,加入DNS試劑5mL,加熱沸煮8min充分顯色,測(cè)顯色液的吸光度,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,加熱回流時(shí)間從1.0h延長(zhǎng)至1.5h時(shí),吸光度值有一定提高,但延長(zhǎng)至2.0h時(shí)吸光度值基本不變,說(shuō)明加熱回流時(shí)間1.5h已經(jīng)使果膠充分水解,故果膠液硫酸加熱回流合適的時(shí)間為1.5h。2.1.5顯色時(shí)間對(duì)顯色液吸光度的影響分別取質(zhì)量濃度為1.000g/L的葡萄糖溶液2mL,置于1～6號(hào)刻度試管中,再分別加入5mLDNS試劑,加熱不同時(shí)間(開(kāi)始沸騰時(shí)計(jì)時(shí)),分別測(cè)其吸光度值。圖6示出加熱顯色時(shí)間對(duì)顯色液吸光度的影響。由圖6可知,加熱時(shí)間少于7min時(shí),顯色液吸光度值隨加熱顯色時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增大。達(dá)到7min后繼續(xù)延長(zhǎng)加熱顯色時(shí)間,吸光度值趨于穩(wěn)定,為保證充分顯色,顯色時(shí)間為8min。2.2計(jì)算結(jié)果表明，橡膠含量在相同的吸光度值測(cè)定條件下,還原性糖的量與吸光度值成正比,可用吸光度值代替還原性糖的量來(lái)計(jì)算。2.2.1ds-ls-ls顯色實(shí)驗(yàn)計(jì)算1000mL萃取液充分回流水解后在540nm波長(zhǎng)下總的DNS顯色吸光度本文實(shí)驗(yàn)從原1000mL萃取液中取50mL,經(jīng)硫酸充分加熱回流后定容于500mL容量瓶中,然后取10mL于刻度試管中,顯色、定容后測(cè)得吸光度值為A1。2.2.2萃取效率的測(cè)定計(jì)算1000mL萃取液淀粉含量M1。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(1)得C=(0.00412+A2)∕0.0127。本文實(shí)驗(yàn)中從原1000mL萃取液中取5mL置于100mL容量瓶中,顯色后定容,測(cè)得吸光度值為A2,根據(jù)A2所配的顯色液的體積和所用萃取液的量,可計(jì)算1000mL萃取液中的淀粉含量淀粉質(zhì)量濃度與碘顯色吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線中淀粉的質(zhì)量濃度單位是mg/L;C為100mL容量瓶中的淀粉質(zhì)量濃度,mg/L;100mL容量瓶中所含有的淀粉量即為(100/1000)C,mg;再乘以從1000mL中取出5mL的倍數(shù)(1000/5),則N2=(100/1000)×(1000/5)=20。2.2.3還原性糖顯色液的制備將測(cè)得的淀粉含量代入淀粉質(zhì)量濃度與淀粉回流液DNS顯色吸光度曲線方程,計(jì)算原萃取液中總淀粉含量對(duì)應(yīng)的水解產(chǎn)物在540nm波長(zhǎng)下DNS顯色液的吸光度值A(chǔ)4。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中質(zhì)量濃度C的單位為mg/25mL,所以25mL刻度試管中顯色的還原性糖對(duì)應(yīng)的淀粉量M=C。則根據(jù)回歸方程(2),吸光度與對(duì)應(yīng)淀粉量的線性方程即為A=0.8875M-0.04172,將總淀粉的量M1代入上式可求得總的淀粉量對(duì)應(yīng)的吸光度萃取液中果膠水解產(chǎn)物在540nm波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的總吸光度2.2.4果膠含量百分率計(jì)算方法由于標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中質(zhì)量濃度C的單位為mg/25mL,所以25mL刻度試管中顯色的還