薄層色譜和紙層析課件

11.6

色譜分離法2023/10/11一、色譜分離法的歷史二、基本概念三、萃取色譜分離法

四、薄層色譜和紙色譜五、色譜分離法的應(yīng)用第七小組制作色譜分離法的歷史2023/10/121901年，俄國植物學(xué)家茨維特將植物色素提取液加到裝有碳酸鈣微粒的玻璃柱子上部，繼而以石油醚淋洗柱子，結(jié)果使不同的色素在在柱中得到分離而形成不同顏色的譜帶?；旌仙赝ㄟ^碳酸鈣微粒被分離成不同色帶的現(xiàn)象，像一束光線通過棱鏡時(shí)被分離成不同色帶的光譜現(xiàn)象一樣。1906年在一篇論文中將這種方法正式命名為色譜法，色譜法由此得名。2023/10/13基本概念：2023/10/14色譜分離法，簡稱色譜法也稱層析法和色層法。兩相：固定相和流動相色譜法就是基于被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的微小差別進(jìn)行分離，是一種多級分離技術(shù)?；驹恚?023/10/15當(dāng)固定相和流動相作相對移動時(shí)，被測物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，使原來微小的差異進(jìn)一步擴(kuò)大，從而使各組分分離。優(yōu)點(diǎn)：分離效率高，能將各種極性相似的物質(zhì)進(jìn)行分離。萃取色譜分離法2023/10/16方法原理：萃取色譜是將溶劑萃取與色譜分離技術(shù)相結(jié)合的液相分配色譜，一般在柱上進(jìn)行，為柱色譜。固定相：涂漬或吸留于多孔、疏水的惰性載體的有機(jī)萃取劑流動相：含有合適的無機(jī)化合物的水溶液分離過程：把含有待測組分的試液置于色譜柱上層，加入流動相，被分離組分從柱頂隨著流動相逐漸向下移動的同時(shí)，它們不斷的在兩相之間進(jìn)行萃取和反萃取多次分配。快速柱色譜柱層析系統(tǒng)2023/10/17影響分離的主要因素2023/10/18固定相載體流動相一、固定相2023/10/19a.固定相：有機(jī)萃取劑，或者有機(jī)分子以化學(xué)鍵與

硅膠表面的硅羥基反反應(yīng)所形成的化學(xué)鍵合固定相。b.固定相的萃取劑的條件：能被載體牢固吸附，在流動相中不溶解。c.如何選擇萃取劑？有機(jī)萃取劑種類很多，根據(jù)分離對象的不同進(jìn)行選擇。選擇萃取劑的幾個(gè)要點(diǎn)：1、溶質(zhì)在萃取劑中的溶解度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在原溶劑中的溶解度。2、萃取劑不能與原溶液中的溶質(zhì)、溶劑反應(yīng)。3、萃取劑要與原溶劑密度不同。4、萃取劑要不與原溶劑互溶2023/10/110二、載體2023/10/111固定相載體的要求：惰性、多孔和孔徑分布均勻、比表面大，有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。常用的載體材料：硅藻土、硅膠、聚四氟乙烯及聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、泡沫塑料、活性炭纖維等。三、流動相2023/10/112通常，以無機(jī)酸作為流動相，所用無機(jī)酸的種類和濃度對分離因數(shù)影響較大，有時(shí)加入無機(jī)鹽以改變分離效果。常用：硝酸、鹽酸、硫酸及這些酸與無機(jī)鹽的混合溶液。由于流動相為水溶液，可以改變流動相的酸度和加入絡(luò)合劑提高分離效果。特別是含有某些絡(luò)合物的流動相，會使一些組分被反萃取而實(shí)現(xiàn)分離。萃取色譜法多用于無機(jī)分析。操作步驟：2023/10/113用浸漬法制備固定相并平衡將有機(jī)萃取劑溶于揮發(fā)性溶劑中，配成適當(dāng)濃度的溶液，將適當(dāng)粒度的載體加入并攪拌或振蕩一段時(shí)間，讓溶劑揮發(fā)，制得固定相。然后用5~10倍于載體體積的流動相流過色譜進(jìn)行平衡。裝柱要求：裝填均勻、致密、無氣泡。進(jìn)樣將試樣液調(diào)至萃取所需的最佳條件，上柱，并控制一定流速流經(jīng)色譜柱。c.洗滌用同樣的流速和與試液相似的水溶液洗滌柱床，以洗去柱內(nèi)未被萃取的其他成分。d.洗脫分離控制一定的溫度和適合的流速，用流

動相洗脫被分離組分。根據(jù)分離組分

的性質(zhì)選擇最佳的流動相組成，使各

組分完全分離，多采用分步洗脫方法。2023/10/114e.色譜柱的再生一般有兩種分離方法：1、講附有固定相的載體取出用有機(jī)溶劑洗去萃取劑，加熱干燥除去殘留有機(jī)溶劑，重新用固定相浸漬載體。2、在柱頂部加入萃取劑的有機(jī)溶劑溶液，緩慢流過色譜柱，柱上浸漬補(bǔ)充載體附著的固定相，再用水洗去柱內(nèi)的過量有機(jī)相。2023/10/115色譜分離原理小結(jié)不同組分性質(zhì)上的微小差別是色譜分離的必要條件不同組分在兩相中進(jìn)行成千上萬次的質(zhì)量交換（分配）是色譜分離的充分條件為什么說色譜法是高效分離方法？沉淀、萃取單級分離相比，色譜是連續(xù)多級分離過程。物質(zhì)間的分離特性差異在色譜過程被"放大"了，因此說色譜法是高效分離方法。2023/10/116色譜分配系數(shù)在色譜分離時(shí)，溶質(zhì)隨著流動相向前遷移，在這個(gè)過程中，它既能進(jìn)入固定相，又能進(jìn)入流動相，即在兩相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)定義為對于確定的色譜體系，K值在低濃度和一定溫度下是個(gè)常數(shù)，它的大小取決于的溶質(zhì)的溶解、吸附、離子交換等性質(zhì)。在色譜分離過程中，K值大的溶質(zhì)，在固定相的停留時(shí)間長，移動速度慢。兩個(gè)化合物之間的K值相差越大，越容易分離。2023/10/117薄層色譜和紙層析18薄層色譜和紙色譜按固定相分類都屬于平面色譜，按兩相狀態(tài)分類均為液相色譜法2023/10/119薄層色譜法是以鋪在平面上支持物體（如玻璃片）上的吸附劑薄層為固定相的一中液相色譜法；紙色譜法的載體多為濾紙，固定相是濾紙上吸著的水分。紙色譜紙色譜法（Paper

Chromatography,PC）是一類以濾紙為載體的色譜法。它具有簡單、分離效能較高、所需儀器設(shè)備價(jià)廉、應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)，因而在有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、生物化學(xué)等方面得到應(yīng)用。2023/10/120紙色譜實(shí)驗(yàn)方法紙色譜原理濾紙由纖維素組成，通常它可以吸附20%的水，其中約6%的水是與纖維素結(jié)合成復(fù)合物，構(gòu)成紙色譜的固定相。而流動相為不與水相溶的有機(jī)溶劑。這樣的紙色譜法屬于分配色譜。在紙色譜分離過程中，由于濾紙纖維素的毛細(xì)管現(xiàn)象，使溶劑在紙上滲透展開(development)，這樣樣品組分在兩相中作反復(fù)多次分配達(dá)到分離。毛細(xì)管現(xiàn)象2023/10/121薄層色譜2023/10/122薄層色譜法是應(yīng)用非常廣泛的色譜方法，這種色譜方法將固定相圖布在金屬或玻璃薄板上形成薄層，用毛細(xì)管、鋼筆或者其他工具將樣品點(diǎn)染于薄板一端，之后將點(diǎn)樣端浸入流動相中，依靠毛細(xì)作用令流動相溶劑沿薄板上行展開樣品。薄層色譜法成本低廉操作簡單，被用于對樣品的粗測、對有機(jī)合成反應(yīng)進(jìn)程的檢測等用途。薄層色譜固定相為吸附劑（例如硅膠、活性氧化鋁、纖維素等），一般將其均勻的涂在玻璃板上制成薄層板。2023/10/123一、方法原理薄層色譜分離裝置圖示1.首先把試液點(diǎn)在薄層的一端離邊緣一定距離處2023/10/1242.晾干3.把點(diǎn)有試液的薄層板浸入到作為展開劑的流動相中（不要把試樣點(diǎn)浸入），流動相裝在加蓋的層析缸中，并具有一定飽和的流動相蒸氣壓。2023/10/1254.由于固定相吸附劑的毛細(xì)管作用，流動相沿著固定相薄層上升，遇到試樣點(diǎn)，試樣溶于流動相并在流動相和固定相之間進(jìn)行吸附-解吸-再吸附-再解吸的多次分配過程。易被吸附的物質(zhì)移動慢些，較難吸附的物質(zhì)移動快些，由于試樣中各組分對吸附劑的親和力強(qiáng)弱不同而得以分離。262023/10/1二、比移值ab2023/10/127原點(diǎn)在平面色譜中，通常用比移值（Rf)衡量各組分的分離情況。根據(jù)左圖得到Rf=a/ba為斑點(diǎn)中心到原點(diǎn)的距離（cm）,b為溶劑前沿到原點(diǎn)的距離（cm）。在確定的色譜條件下，Rf值應(yīng)為一常數(shù)，其值在0

~

1之間。利用Rf值的特征性可對各組分進(jìn)行定性鑒定。實(shí)際分離中，各種物質(zhì)的Rf值應(yīng)控制在0.05

~

0.85之間，兩物質(zhì)的Rf值差值應(yīng)大于0.05才能分離。影響Rf的主要因素2023/10/128展開劑的pH：弱酸和弱堿的離解受pH影響，離

解度越大，極性越強(qiáng)，越易分配在極性強(qiáng)的一相；溫度：溫度變化會引起分配系數(shù)變化，也可能改變展開劑的組成；展開距離：在相同的條件下，展開距離大，Rf值大；層析缸的飽和程度：未飽和時(shí)，Rf值可能增大；共存物質(zhì)。三.固定相2023/10/129薄層色譜的固定相除鋪在玻璃板上的吸附劑硅

膠、活性氧化鋁、纖維素、及聚酰胺外，還有

在惰性薄層上涂的固定液，進(jìn)行吸附分配分離。固定相的要求：1.有一定的比表面積、機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性；2.在流動相中不溶解；3.具有可逆吸附能力。一些化合物的吸附能力大小順序?yàn)椋猴柡蜔N<不飽和烴<醚<酯<醛<酮<胺<羥基化合物<酸和堿四、流動相2023/10/130正相薄層色譜中，流動相多為含有少許有機(jī)酸或堿的有機(jī)溶劑；反相色譜則多采用無機(jī)酸水溶液。薄層色譜的展開劑主要根據(jù)試樣的性質(zhì)及分離機(jī)制選擇。對于吸附性薄層色譜，主要考慮流動相級性，級性大小與洗脫能力成正比，一些主要純?nèi)軇┑臉O性大小順序?yàn)椋菏兔?lt;環(huán)乙烷<四氯化碳<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸流動相可以用單一溶劑，也可用混合溶劑，來調(diào)整流動相的極性。一般對于極性物質(zhì)，選擇吸附活性小的吸附劑和極性大的流動相；對于非極性物質(zhì)，選擇吸附活性大的吸附劑和極性小或非極性的流動相。萃取色譜分離法2023/10/131萃取色譜分離法，用于無機(jī)物分離，實(shí)際上是一種反相分配色譜法，它具有萃取方法的簡便性，又有色譜分離的高效性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常是將有機(jī)萃取劑溶于揮發(fā)性溶劑中配成適當(dāng)濃度的溶液，把載體浸漬在此溶液中，攪拌或振蕩一端時(shí)間后，讓溶劑揮發(fā)制成固定相。這里簡單介紹一個(gè)應(yīng)用：萃取色譜分離法2023/10/132Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)和UO22+混合物的反相分配色譜分離

采用三正辛烷-纖維素色譜柱，分別10

mol.l-1HCl，6

mol.l-1

HCl和0.05HNO3為洗脫液，可以將

Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)和UO22+很好地分離。薄層色譜法的應(yīng)用2023/10/133薄層色譜法操作簡便，廣泛應(yīng)用于各種有機(jī)物和無機(jī)物的分離鑒定，如用于研究反應(yīng)歷程，也可以在實(shí)驗(yàn)室制取少量純品。這里簡單介紹幾個(gè)方面的應(yīng)用：1、反應(yīng)終點(diǎn)的控制及產(chǎn)物的分離控制在化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后，取少量反應(yīng)液點(diǎn)樣分析，了解還剩下多少原料未起作用，從而判斷和控制反應(yīng)終點(diǎn)。 對難分離的反應(yīng)產(chǎn)物可采用柱色譜純化，這時(shí)可采用點(diǎn)板分析確定分離程度。薄層色譜法的應(yīng)用2023/10/1342、產(chǎn)品質(zhì)量控制及雜質(zhì)檢驗(yàn)過去，有機(jī)產(chǎn)品的質(zhì)量一般常以熔點(diǎn)等物理常數(shù)作為鑒定的指標(biāo)來進(jìn)行

控制。用薄層色譜法來控制雜質(zhì)限量，則

靈敏度更高，結(jié)果更可靠，在一些國家的

藥典中已有使用。為此，取一定量的試樣，點(diǎn)樣展開后顯色，除了主斑點(diǎn)外，不出現(xiàn)

其它雜質(zhì)斑點(diǎn)，或雜質(zhì)斑點(diǎn)的大小及顏色

深度不超過對照用的標(biāo)準(zhǔn)斑為產(chǎn)品合格。薄層色譜法的應(yīng)用2023/10/1353、分離檢測植物中的維生素B1，B2，B6固定相：硅膠G+0.5%CMC水溶液[(1:3),質(zhì)量體積比]流動相(展開劑)：氯仿-乙醇-丙酮-氨水(20:20:20:10,V/V)

提取液:水飽和的正丁醇-6%TritonX-100乙醇[(23:2),體積比]用薄層雙波長掃描儀測定。紙色譜法應(yīng)用舉例2023/10/136紙色譜法不僅適用于分離水溶性或極性較大的有機(jī)物的分離和檢出，也可以用于分離和檢