豬流行性腹瀉病毒S基因的研究進展

豬流行性腹瀉病毒S基因的研究進展摘要：豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引發(fā)的豬的一種急性腸道傳染病，是造成仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來，豬流行性腹瀉的流行區(qū)域有擴大的趨勢，已成為中國甚至全世界最常見的豬腹瀉傳染病之一。通過對豬流行性腹瀉病毒的基因組概述，S基因及其編碼蛋白的功效特性、基于豬流行腹瀉病毒S基因的診療技術及其疫苗研究進展等方面的進行綜述。核心詞：豬流行性腹瀉病毒；S基因；S蛋白；診療技術；疫苗進展Abstract:Swineepidemicdiarrheaisanacuteintestinalinfectioncausedbyporcineepidemicdiarrheavirus,whichisoneoftheimportantdiseasesthatleadtotheearlydeathofpiglets.Inrecentyears,epidemicareasofswineepidemicdiarrheahavebeenexpandingandhavebecomeoneofthemostcommonporcinediarrhea-relateddiseasesinChinaandevenintheworld.ThisreviewsummarizesthegenomeofSwineEpidemicDiarrheavirusandthefunctionalpropertiesofSgeneanditsencodedproteinbasedonthediagnostictechniqueofSgeneofswineepidemicdiarrheavirusandtheresearchprogressofitsvaccine.Keywords:Porcineepidemicdiarrheavirus;Sgene;Sprotein;diagnostictechnique;vaccineprogression引言20世紀70年代初，豬流行性腹瀉（PED）在歐洲等國如英國、荷蘭、比利時和捷克就被發(fā)現(xiàn)，被認定為一種急性腸道傳染病，其重要特點為腹瀉、脫水以及嘔吐。1977年，成功的分離到這種冠狀病毒并命名為流行性腹瀉病毒（PEDV）。與歐洲等國同時期，我國也出現(xiàn)了新生仔豬的嚴重腹瀉并死亡的事件，采用多個抗生素均無效果，當時被認為是胃腸炎的傳染病。到了20世紀80年代初，采用酶標法證明了這種流行病為豬流行性腹瀉病毒[1]~[3]。PED現(xiàn)在在全球范疇內(nèi)流行廣泛，特別是在亞洲國家如中國、日本和韓國，這已經(jīng)給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的沖擊?，F(xiàn)已表明豬流行性腹瀉重要是由于豬流行性腹瀉病毒造成的一種急性的腸道傳染病。PEVD能夠造成不同年紀以及不同品種的豬染病引發(fā)嚴重的腹瀉，例如成年母豬20%～85%發(fā)病，架子豬、哺乳仔豬以及育肥豬100%的發(fā)病。重要病癥為：癥狀輕的為日齡大，癥狀重的為日齡小。具體體現(xiàn)為：成年豬體現(xiàn)為厭食與嘔吐，育肥豬和斷奶豬的腹瀉僅持續(xù)7d左右，癥狀較輕。而日齡較小的哺乳仔豬死亡率達成50%，出現(xiàn)嚴重的脫水癥狀。PEDV屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，引發(fā)的病癥日趨復雜，經(jīng)常出現(xiàn)交叉感染的狀況，PED造成豬的整潔度差、成活率減少、減緩生長速度、推遲上市時間、病毒的易感性、增重減少、增加額外消耗、減少飼料運用率、減少牲畜抗病力、增加對細菌并增加發(fā)病率，提高治療費用、豬拉稀體重下降、休克、死亡、牲畜脫水等十分嚴重的后果，因此需要引發(fā)從業(yè)人員的高度重視[5]。１PEDV的基因組研究PEDV基因組屬于單股正鏈感染性的RNA，基因組全長28Kb左右，與其它冠狀病毒相似，在基因組5’端有一種帽子構造（cap），基因組5′非翻譯區(qū)（5’URT）長度為300bp左右[6]~[8]。3′端有一種polyA尾，基因組3’非翻譯區(qū)（3’URT）長度為330bp左右，剩余的基因組涉及6個開放閱讀框（OFR），從5’→3’端依次為ORF1（0bp左右）、S基因（4100bp左右）、ORF3（670bp左右）、E基因（230bp左右）、M基因（680bp左右）、N基因（1300bp左右）。PEDV基因重要編碼構造蛋白分別為S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白。Ｓ蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白[9]，由1383個氨基酸構成，含有29個潛在的糖基化位點，同其它冠狀病毒相似。E蛋白是最小的構造蛋白，該蛋白位于病毒粒子的囊膜上，氨基酸包埋在脂質(zhì)雙層中且N-端朝向病毒粒子的外部，-OH位于粒子內(nèi)部，單次跨膜。M蛋白是由226個氨基酸構成、分子質(zhì)量為27-32Ku之間的膜糖蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中含有重要作用［9］。N蛋白由441個氨基酸組成，分子質(zhì)量為55-58Ku，其中含有6-7個絲氨酸磷酸化位點，是PEDV已知構造蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是構成病毒核衣殼的構造基礎，在病毒基因組的轉錄復制中起重要作[10]。2S基因S基因編碼病毒的纖突蛋白，該基因的啟動密碼子普通并不是用于啟動蛋白質(zhì)的合成，而是翻譯分子質(zhì)量為1383個氨基酸編碼的多肽。S基因核苷酸長短不一，其核苷酸長度在4143bp～4161bp之間[11]~[13]。現(xiàn)在，有關PEDV的S基因的分子流行病學數(shù)據(jù)研究較多，通過研究發(fā)現(xiàn)，S基因可用來作為PEDV基因分型的一種根據(jù)，可將其分為2個大的基因群，G1基因群和G2基因群，各個亞群均可細分為2個小的遺傳分支，即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。研究還發(fā)現(xiàn)，G1基因群均存在有堿基缺失或插入現(xiàn)象（以基因插入為主）；而G2基因群則不同，其重要存在有堿基缺失（3bp或6bp）現(xiàn)象[14]。氨基酸分析表明，G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸點突變外，又存在氨基酸插入和缺失現(xiàn)象；但G2基因群PEDV毒株卻不存在氨基酸插入現(xiàn)象，以氨基酸點突變?yōu)橹?。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列與CV777（G2基因群代表株）的同源性為93.0％～93.8％[15]-[18]。由于PEDV只有一種血清型，氨基酸的變異并不會對血清型產(chǎn)生影響，但推測其和疫苗的推薦使用親密有關。對PEDV新流行株的S基因序列分析發(fā)現(xiàn)，PEDV流行株S基因已出現(xiàn)缺失（197aa）和插入（4aa），表明隨著疫苗的使用，PEDV基因組進化趨勢增強[18]。以S基因繪制PEDV遺傳進化樹發(fā)現(xiàn)，PEDV可分為2個明顯的分支G1和G2，G1分支重要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分離株，而G2分支均為新PEDV流行株，重要在韓國、美國等地流行[19]-[21]。3S蛋白S蛋白是由1383個氨基酸構成、分子質(zhì)量為180~220ku、位于病毒粒子表面的纖突蛋白，它在識別靶細胞，增進病毒和細胞膜的融合中發(fā)揮重要地生物學作用[22]~[23]。由于含有PEDV重要的抗原決定簇，有較好的免疫原性，故在機體的抗病毒免疫中起重要[24]，且它在構造蛋白中的含量最高，用其制備的免疫血清是病毒抗原檢測試劑的良好擇[24]。S蛋白缺少蛋白水解位點，而TGEV在此位點上可產(chǎn)生氨基和羧基亞單位S1S2。序列比較分析證明PEDV同HCV229E抗原有關。但PEDV還另外有250個殘基的N端區(qū)，而這是HCV229E和TGEV的呼吸道變異株PRCV所缺少的[25]~[27]。盡管S蛋白在感染過程不被切割成S1和S2亞基，但是在相對應的位置上存在這2個基序，這為PEDVS蛋白的受體結合域、抗原區(qū)(S1區(qū))和膜融合區(qū)(S2區(qū))的人為劃分提供了根據(jù)[28]。其中S蛋白的C端有一疏水殘基鏈(1322~1337個氨基酸)，預測在此處可形成α螺旋，起著膜受體的作用。孫東波等[27]對已知冠狀病毒S蛋白抗原表位和抗原表位區(qū)進行了分析，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在已經(jīng)鑒定的冠狀病毒S蛋白抗原表位重要位于S蛋白N2端1/2的區(qū)域，成果在S蛋白Sl區(qū)83~276氨基酸區(qū)域預測到1個抗原表位區(qū)。另外，S蛋白有27~29個潛在的糖基化位點，在pH4.0低滲非離子溶劑中溶解度最大[29]~[31]。其在病毒粒子成熟后不能被細胞蛋白酶切割，這樣就減少了病毒的細胞融合力和感染力，這也是PEDV人工細胞培養(yǎng)困難的因素。4基于PEDV?S基因的診療技術由于PED與TGE有著極為相似的臨床癥狀和病理變化,?因此確診PED需要結合實驗室診療辦法?，F(xiàn)在，用于PEDV檢測的辦法有許多，例如病毒分離、免疫電鏡觀察、病毒的中和實驗、免疫熒光技術等，這些辦法均能對PED做出精確的診療,?但這些技術操作復雜并且耗時[32]~[34]。病毒與宿主細胞吸附和受體識別的重要蛋白之一是S蛋白，且S?蛋白具良好的反映原性和免疫原性，因此在免疫學診療技術中應用較廣[35]。有研究表明，用N蛋白和S蛋白建立ELISA辦法分別進行比較探索，發(fā)現(xiàn)在免疫測定中S-ELISA法更為有效。研究發(fā)現(xiàn)，豬感染豬流行性腹瀉后，檢測到血清中的抗N蛋白抗體遠不及抗S蛋白抗體，可在更長的時間中檢測到抗S蛋白的抗體[36]~[38]。隨著人們對ELISA辦法不停地進一步研究,該辦法被廣泛地應用到臨床實踐中，此辦法可用于檢測抗體，也可檢測抗原，相比較其它檢測辦法，更為簡便、敏感。Gerber等[39]根據(jù)PEDV?S1蛋白的生物學特性建立了間接ELISA辦法，對檢測IgA和IgG抗體都含有良好的特異性和敏感性。Paudel等[40]根據(jù)PEDV?S基因分別體現(xiàn)的S1蛋白、S2蛋白、S3蛋白，分別建立了ELISA辦法，對400頭免疫疫苗的豬血清進行抗體水平檢測，與血清中和實驗(SN)相比、S3基因體現(xiàn)蛋白建立的ELISA辦法更符合SN，表明S3基因是重要的中和抗原基因,在遺傳免疫中起著重要作用[41]。Ishikawa等[42]根據(jù)S基因序列設計了一對特異性引物，擴增出854?bp大小的目的片段,?成功地建立了診療PEDV的RT-PCR法。S基因保守區(qū)域也能夠作為檢測靶點[43]~[44]。5基于S基因的疫苗研究進展將PEDV的S基因在煙草中進行體現(xiàn)，將提取的轉基因植物蛋白給小鼠注射，然后進行血清蝕斑減數(shù)中和測定，實驗成果證明S基因含有良好的免疫原性，通過用這種轉基因煙草飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)其能夠刺激小鼠產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和黏膜免疫[45]~[47]。以煙草花葉病毒為載體將S蛋白中和表位在無煙堿煙草中進行體現(xiàn)，體現(xiàn)蛋白接種仔豬，發(fā)現(xiàn)能夠誘導仔豬機體產(chǎn)生保護性免疫反映。這些研究成果為PEDV轉基因疫苗的開發(fā)與研究奠定了一定基礎，但是研究發(fā)現(xiàn)，轉基因植物本身體現(xiàn)抗原的效率過低，并且其生物安全性也有待進一步講究[38]。通過以重組腺病毒和重組沙門氏菌作為活載體，構建的PEDV疫苗能夠針對病毒，產(chǎn)生有效地全身免疫反映和局部黏膜免疫應答[48]。以重組PEDVS1蛋白和N蛋白的干酪乳桿菌給豬和小鼠口服，即使不能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，但卻能激發(fā)高水平局部黏膜IgA抗體和非中和抗體的全身免疫反映。由于活載體疫苗存在生物安全性、遺傳穩(wěn)定性尚未擬定的缺點，因此國際上商品化的活疫苗不常見[49]。趙德等將PEDVS基因中含有保護性的C-COE基因片段與乳酸菌重組后進行小鼠免疫，前兩次間隔1周免疫1次，共進行3次免疫，最后一次免疫間隔2周后進行PEDV抗體檢測，實驗成果顯示以乳酸菌載體制備的疫苗，能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，另外，口服免疫途徑比注射產(chǎn)生高水平的抗體更容易，進一步證明乳酸菌載體疫苗更適宜于口服免疫[50]。焦茂興等將含有PEDV疫苗株的sM、M、S基因與腺病毒進行重組構建了重組腺病毒,研制了PED口服重組腺病毒疫苗。6總結現(xiàn)在對PEDV

S基因的研究，重要集中在基因構造分析及功效預測、蛋白免疫原性分析、遺傳進化分析等方面。經(jīng)重組菌或重組病毒等多個形式體現(xiàn)的S基因的多個保守性中和抗原表位，在通過以小鼠作為動物模型的實驗中體現(xiàn)出良好的免疫原性的優(yōu)勢，但同時也存在不少令人擔憂的問題，例如，重組菌或重組蛋白誘導細胞和體液免疫水平不夠明顯，與傳統(tǒng)疫苗相比存在保護效力局限性的缺點，新型診療辦法或疫苗在臨床實踐應用較少等[51]。另外，雖已證明pAPN為PEDV細胞受體，但有關S蛋白與pAPN受體結合后如何進行一系列信號轉導促使細胞膜重排和融合等機制還需進一步研究來揭示。參考文獻[1]陳剛,李偉,張陽,等.豬流行性腹瀉的研究進展[J].世界華人消化雜志,,1:11.[2]李蕾,劉新文,殷穎珊.豬流行性腹瀉研究進展[J].南方農(nóng)業(yè),,8(15):136-137.[3]賴婷婷,陳樨,張如梅.豬流行性腹瀉病毒基因組研究進展[J].動物醫(yī)學進展,,36(06):119-121.[4]劉政龍,王金良,沈志強.豬流行性腹瀉病毒研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),,42(09):2506-2511.[5]孔園園,范京惠,左玉柱,邸晶美,劉寶京,羅尚星.豬流行性腹瀉病毒S基因的研究進展[J].豬業(yè)科學,,33(11):102-105.[6]陳弟詩,任玉鵬,張斌,李麗,聶艷如,周莉媛.豬流行性腹瀉病毒S基因研究進展[J].動物醫(yī)學進展,,35(07):77-81.[7]郭春和,黃毓茂,項林盛,唐麗云,甘建平,郭強,焦茂興.豬流行性腹瀉病毒構造蛋白及疫苗的研究進展[J].畜牧與獸醫(yī),,43(12):83-87.[8]范京惠,左玉柱,任曉峰.豬流行性腹瀉病毒的基因構造及其診療技術[J].世界華人消化雜志,,21(01):54-59.[9]王鳳,湯德元,李春燕,王彬,張曉杰,甘振磊,劉志杰.豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究[J].豬業(yè)科學,,27(12):42-47.[10]張月,王敏,胡莉萍,李玉杰,孔祥華,曹振山,姜秀云.豬流行性腹瀉病毒分子構造、診療術和疫苗的研究進展[J].山東畜牧獸醫(yī),,36(01):77-79.[11]HuyNX，YangMS，KimTG．ExpressionofaCholeraToxinBSubunit-NeutralizingEpitopeofthePorcineEpidemicDiarrheaVirusFusionGeneinTransgenicLettuce(LactucasativaL)［J］．Mo-lecularBiotechnolog，48:201-209．[12]MasterPS．Themolecularbiologyofcoronaviruses［J］．AdvVirusRes，，66:193-292．[13]斯特勞BE．豬病學［M］．8版．趙德明，張仲秋，沈建忠，譯．北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，:181-187．[14]TetsuoS，NatsumiT，AtsushiK，etal．Mutationsinthespikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusassociatedwithgrowthadaptationinvitroandattenuationofvirulenceinvivo［J］．VirusGenes，，43:72-78．[15]孫東波，馮力，時洪艷，等．豬流行性腹瀉病毒分子生物學研究進展［J］．動物醫(yī)學進展，，27(10):11-14．[16]KweonCH，KwonBJ，JungTS，etal．Isolationofporcineepi-demicdiarrheavirus(PEDV)inKorea［J］．KoreanJVetRes，1993，33:249-254．[17]KocherhansR，BridgenAAckermannM，etal．Completionoftheporcineepidemicdiarrhoeacoronavirus(PEDV)genomesequence［J］．Genes，，23:137-144．[18]KubotaS，SasakiO，AmimotoK，etal．Detectionofporcineepi-demicdiarheavirususingpolymerasechainreactionandcomparisonofthenucleocapsidproteingenesamongstrainsofthevirus［J］．JVetMedSci，1999，61:827-830．[19]BridgenA，KocherhansR，ToblerK，etal．Furtheranalysisofthegenomeofporcineepidemicdiarhoeavirus［J］．AdvExpMedBiol，1998，440:781-786．[20]BrianDA，BancRS．Coronavirusgenomestructureandreplication［J］．CurrTopMicrobiolImmunol，，287:1-30．[21]SinghM．AnovelinternalopenreadingframeproductexpressedfromapolycistronicmRNAofporcineepidemicdiarrhoeavirusmaynotcontributetovirus［J］．JGenViro1，1999，80:l959-1963．[22]DuarteM，LaudeH．Sequenceofthespikeproteinoftheporcineepidemicdiarhoeavirus［J］．JGenVira1994，75:1195-1200．[23]KmlgTJ，SeoJE，KhnDH，etal．CloningandsequenceanalysisoftheKoreanstrainofspikegeneofPorcineepidemicdiarrheavirusandexpressionofitsneutralizingepitopeinplants［J］．ProteinExprPurif，，41(2):378-383．[24]姜艷平，葛俊偉，汪淼，等．豬流行性腹瀉病毒S基因片段的原核體現(xiàn)及其體現(xiàn)產(chǎn)物的反映原性［J］．中國獸醫(yī)科學，，39(7):602-607．[25]KIMSY,SONGDS,PARK?B?K.Differential?detection?of?transmissible?gastroenteritis?virus?and?porcine?epidemic?diarrhea?virus?by?duplex?RT-PCR[J].J?VetDiagn?Invest?:13:?516-520.[26]Gerber?PF,Gong?Q,Huang?YW,et?al.?Detection?of?antibodies?againstporcineepidemicdiarrheavirusinserumandcolostrumbyindirectELISA[J].Veterinary?Journal,,202(1):33-36.[27]PaudelS,ParkJE,ShinHJ,et?al.Comparision?of?serum?neutralization?and?enzyme?linked?immunosorbent?assay?on?sera?from?epidemic?diarrhea?virus?vaccined?pigs[J].Veterinary?Quarterly,,34(4):218-223.?[28]KANGTJ,KIMYS,?et?al.?Expressionofthesynthtic?neutralizing?epitope?gene?of?porcineepidemicdiarrheavirusintobaccoplantswithoutnicotine[J].Vaccine,?,23:2294-22997.[29]?Brian?DA，Baric?RS．Corona?virus?genome?structure?and?replication[J]．Curr?Top?Microbiol?Immunol，，287：1-30．[30]?Knipe?DM，Howley?PM，Griffin?DE，et?a?l．Fields?virology(5thed)[M].?Phi-ladelphia:?Lippincott?Williams﹠Wilkins，：707-736.[31]?Kang?TJ，Seo?JE，Kim?DH，et?a1．Cloning?and?sequence?analysis?of?the?Korean?strain?of?spike?gene?of?Porcine?epidemic?diarrhea?virus?and?expression?of?its?neutralizing?epitopeinplants[J]．Protein?Expr?Purif，，41（2）：378-383．[32]?H.F.Egberink，J.?Ederveen，P.Callebaut，et?a1．Characterization?of?the?structural?proteins?of?porcine?epizootic?diarrhea?virus，?strain?CV777，Am.J.?Vet.Res.49?（1988）：1320-1324．[33]?Fan?JH，LiYJ．Cloning?and?sequence?analysis?of?the?M?gene?of?Porcine?epidemic?diarrhea?virus?LJB/03[J]．Virus?Genes．，30（1）：69-73．[34]?Lee?HK，Yeo?SG．Cloning?and?sequence?analysis?of?the?nu?cleocapsid?gene?of?Porcine?epidemic?diarrhea?virus?Chinju99[J]．Virus?Genes，，26（2）：207-212．[35]?余麗蕓，侯喜林．流行性腹瀉病毒M基因與甲病毒載體重組RNA的構建[J]．動物醫(yī)學進展，，26（5）：73-76．[8]?王明，馬思奇，等．豬流行性腹瀉滅活疫苗的研究[J]．中國畜禽傳染病，1993，（5）：17-19．[36]?馬思奇，王明，馮力，等．豬流行性腹瀉病毒適應vero細胞培養(yǎng)及以傳代細胞毒制備氫氧化鋁滅活疫苗免疫效力實驗[J]．中國畜禽傳染病，1994（2）：15-18．[37]?Song?DS，Park?BK，et?al．Oral?efficacy?of?Vero?Cell?Attenuated?Porcine?Epidemic?Diarrhea?Virus?DR13?Strain[J]．Res?Vet?Sci，，82(1)：134-140．[38]?Kweon?CH，Kang?YB，Kwon?BJ，et?al．Derivation?of?Attenuated?Porcine?Epidemic?Diarrhea?Virus(PEDV)?as?Vaccine?Candidate[J]．Vac