藏靈菇奶純培養(yǎng)發(fā)酵劑的配方優(yōu)化研究

藏靈菇奶純培養(yǎng)發(fā)酵劑的配方優(yōu)化研究

0不同菌種組合的發(fā)酵發(fā)酵【研究意義】冷杉是一個(gè)像饅頭一樣的乳白色和骨料狀的塊體。它的形狀像多汁的顆粒。它可以在新鮮的牛奶中生長(zhǎng)，也可以分享其特征，為后代產(chǎn)生新的顆粒。溫室下用熱梨花浸泡的牛奶就是鮮靈蘑菇的牛奶。由于其獨(dú)特的保健效果，它在人們中廣為傳播。由于藏靈菇上棲息著多種微生物,用藏靈菇浸泡牛奶的過(guò)程實(shí)質(zhì)上是一種多菌種參與的發(fā)酵過(guò)程。由于存在菌相比例易變,不易控制,粒的回收、清洗及相應(yīng)的再處理后的使用過(guò)于麻煩等缺陷,很難依靠藏靈菇原粒來(lái)進(jìn)行這種發(fā)酵奶的規(guī)?；a(chǎn)。因此,需要開(kāi)發(fā)出純培養(yǎng)發(fā)酵劑才能進(jìn)行穩(wěn)定的工業(yè)化生產(chǎn)。【前人研究進(jìn)展】以前對(duì)這種由多菌種參與的純培養(yǎng)發(fā)酵劑的研制是在菌種分離鑒定的基礎(chǔ)上,根據(jù)產(chǎn)品的感官特性及發(fā)酵產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì),進(jìn)行大量的菌種組合搭配試驗(yàn),Gobbetti等利用從開(kāi)菲爾中分離到的菌株進(jìn)行多種比例混合,發(fā)酵牛奶,嘗試用混合菌種代替開(kāi)菲爾粒;Beshkova等利用從開(kāi)菲爾中分離到的菌株通過(guò)隨機(jī)組合,進(jìn)行純培養(yǎng)發(fā)酵劑的研究;這種以大量試驗(yàn)為基礎(chǔ)獲得的試驗(yàn)結(jié)果不但不能保證達(dá)到最佳,而且需要耗費(fèi)大量的試驗(yàn)原材料,影響研究進(jìn)度?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為此,本文采用軟件設(shè)計(jì)專家(Design-Expert6.0.5)中的混料(mixture)設(shè)計(jì),將從藏靈菇奶中篩選出的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行優(yōu)化組合,按軟件給出的比例進(jìn)行混合,發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵奶中乳酸、丁二酮、乙醇和二氧化碳的量?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)軟件分析不同組合與產(chǎn)物之間的關(guān)系,選擇最優(yōu)的菌種組合。1材料和方法1.1不同菌株的微囊化培養(yǎng)乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)微膠囊(7.8×1010CFU/g),腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)微膠囊(4.2×1010CFU/g),開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefiri)微膠囊(2.6×1010CFU/g),干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)微膠囊(6.5×1010CFU/g),馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)微膠囊(8.3×109CFU/g),以上菌株是從藏靈菇中分離,并經(jīng)微囊化處理和高密培養(yǎng)。1.2混料設(shè)計(jì)方法借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件DesignExpert(Version6.0.5,Stat-EaseInt.Co.,Minneapolis,MN.USA),采用混料(mixture)設(shè)計(jì)中的D-Optional方法,對(duì)由各種微囊化菌組成的混合發(fā)酵劑的配方進(jìn)行優(yōu)化?；炝显O(shè)計(jì)主要是研究各試驗(yàn)因子的不同比例對(duì)反映變量的關(guān)系,與混料的總量無(wú)關(guān)?；炝显囼?yàn)的設(shè)計(jì)方法,自1958年Scheffe提出了單形格子與單形重心設(shè)計(jì)后,發(fā)展至今天,已有多種設(shè)計(jì)方法。本研究對(duì)每種菌在混合發(fā)酵劑中占的比例進(jìn)行了限制(10%~50%),屬限制成分上下界的混料設(shè)計(jì),其形式為:z1+z2+···+zp=1,0≤Li≤zi≤Ui≤1,i=1,2,···,P。這種方法不僅可以建立連續(xù)變量曲面模型,對(duì)配方中的各成分及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià),還可以根據(jù)設(shè)定目標(biāo)進(jìn)行成分組成的優(yōu)化,確定各成分的最佳比例。該方法現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于冶金、化工、藥物和食品工業(yè)等方面的配方設(shè)計(jì)[7~10],并取得了良好的效果。本試驗(yàn)選用微囊化乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌、開(kāi)菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌、克魯維酵母為混合發(fā)酵劑中的成分,各成分在配方中所占的百分比從10%~50%內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。1.3乳酸、丁二酮、乙按試驗(yàn)設(shè)計(jì)給出的比例進(jìn)行組合,接種10%的混合微膠囊于無(wú)菌脫脂牛奶中(添加0.08%的檸檬酸),放入發(fā)酵罐中(3L),保持溫度25℃,轉(zhuǎn)速80r/min,發(fā)酵10h。發(fā)酵液經(jīng)處理后進(jìn)行乳酸﹑丁二酮﹑乙醇和二氧化碳檢測(cè)。發(fā)酵奶中乳酸的檢測(cè)方法(HPLC法),參考文獻(xiàn);發(fā)酵奶中丁二酮、乙醇的檢測(cè)方法(GC法),參考文獻(xiàn);二氧化碳檢測(cè)(酶終點(diǎn)法),參考文獻(xiàn)。2結(jié)果與分析2.1應(yīng)值乳酸二次擬合表1列出了用混合發(fā)酵劑發(fā)酵后乳中乳酸、丁二酮、乙醇、二氧化碳的試驗(yàn)結(jié)果及其預(yù)測(cè)值,利用上述軟件,對(duì)響應(yīng)值乳酸的試驗(yàn)值進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,分別建立4個(gè)指標(biāo)(Y乳酸、Y丁二酮、Y乙醇、Y二氧化碳)的回歸模型,各回歸模型方程如下:結(jié)果表明,4個(gè)指標(biāo)的線性模型都不顯著,二次模型都達(dá)到0.001的極顯著水平,校正后的決定系數(shù)(R2)達(dá)到0.9754~0.9910,表明二次模型能很好地?cái)M合各指標(biāo)與配方比例。2.2乳酸乳桿菌和克魯維酵母的交互作用混料設(shè)計(jì)可以根據(jù)各組分的三元等值線圖直觀地觀察各組分間的變化對(duì)指標(biāo)的影響。本研究的配方中共有5種成分,固定其中的兩種成分,可以比較其它3種成分的交互作用對(duì)指標(biāo)的影響。圖1是在干酪乳桿菌和克魯維酵母在固定水平時(shí),乳酸乳球菌、明串珠菌、開(kāi)菲爾乳桿菌的交互作用對(duì)乳酸生成量的影響;圖2是在干酪乳桿菌和克魯維酵母固定水平時(shí),乳酸乳球菌﹑開(kāi)菲爾乳桿菌和明串珠菌的交互作用對(duì)丁二酮產(chǎn)量的影響;圖3是在干酪乳桿菌和開(kāi)菲爾乳桿菌固定水平時(shí),乳酸乳球菌﹑明串珠菌和克魯維酵母的交互作用對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響;圖4是在干酪乳桿菌和乳酸乳球菌固定水平時(shí),開(kāi)菲爾乳桿菌﹑明串珠菌和克魯維酵母的交互作用對(duì)二氧化碳產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,乳酸乳球菌和開(kāi)菲爾乳桿菌對(duì)乳酸產(chǎn)量影響較大,當(dāng)它們的配比都為35%時(shí),乳酸的預(yù)測(cè)值最大,其值為8.16g·L-1;乳酸乳球菌和明串珠菌對(duì)丁二酮產(chǎn)量的影響較大,當(dāng)乳酸乳球菌的配比為31%,明串珠菌的配比為39%時(shí),丁二酮的預(yù)測(cè)值最大,其值為77.23mg·L-1;克魯維酵母和明串珠菌對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響較大,當(dāng)克魯維酵母的配比為42%,明串珠菌的配比為28%時(shí),乙醇的預(yù)測(cè)值最大,其值為4259mg·L-1;二氧化碳的產(chǎn)量受克魯維酵母的影響最大,當(dāng)克魯維酵母取最大值(50%)時(shí),二氧化碳的預(yù)測(cè)值最大,其值為2.12g·L-1。2.3微囊化菌種篩選和預(yù)測(cè)值以上分析了各成分對(duì)單個(gè)響應(yīng)值的影響,為了滿足所有期望的響應(yīng)值,用軟件的最優(yōu)化功能(optimization)設(shè)定各組分的變化范圍,然后設(shè)定所期望的響應(yīng)值(表2),軟件運(yùn)行后,從隨機(jī)組合開(kāi)始進(jìn)行最陡爬坡預(yù)測(cè),直到目標(biāo)響應(yīng)值。同時(shí)給出了10組達(dá)到或接近目標(biāo)響應(yīng)值的10個(gè)組合,并提供了預(yù)測(cè)值(表3)。從表3可以看出,最優(yōu)組合為微囊化乳酸乳球菌(27%),微囊化明串珠菌(37%),微囊化開(kāi)菲爾乳桿菌(11%),微囊化干酪乳桿菌(10%),微囊化克魯維酵母(15%)。按照優(yōu)化后的配方將各種微囊化菌進(jìn)行混合,按1.3的方法進(jìn)行牛奶發(fā)酵試驗(yàn),測(cè)得乳酸、丁二酮、乙醇、二氧化碳的量分別為7.61g·L-1、77.32mg·L-1、3000mg·L-1、1.55g·L-1,與預(yù)測(cè)值一致。3混料在飲料配方優(yōu)化中的應(yīng)用將混料均勻設(shè)計(jì)應(yīng)用于食品、化工、復(fù)合肥、農(nóng)藥等產(chǎn)品的配方試驗(yàn)中,可通過(guò)較少的試驗(yàn)次數(shù),利用回歸分析,獲得配方與性能之間的定量關(guān)系,從而得到較佳的配方,起到事半功倍的作用。張彩等采用混料設(shè)計(jì)進(jìn)行了植物蛋白飲料配方優(yōu)化研究,獲得了由核桃漿、花生漿、豆?jié){組成的最佳配方;童華榮等采用混料均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化了茶葉的拼配,獲得了成本最低的最優(yōu)配方;劉春光等研究了混料設(shè)計(jì)中的單形重心設(shè)計(jì)在復(fù)合肥中氮、磷、鉀配比上的應(yīng)用,驗(yàn)證了混料設(shè)計(jì)在肥料配比研究中的可行性。本文采用混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,以發(fā)酵奶的主要風(fēng)味成分為指標(biāo),進(jìn)行菌種的多目標(biāo)優(yōu)化,探討混合發(fā)酵劑組合優(yōu)化的新方法。通過(guò)各指標(biāo)的回歸模型的建立,各組分間的交互作用分析,結(jié)合混料設(shè)計(jì)分析軟件的優(yōu)化功能,表明混料設(shè)計(jì)可有效地應(yīng)用于多菌種參與的混合發(fā)酵劑配方優(yōu)化。這種方法可縮短新型發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)周期,提高設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。4發(fā)酵組分的篩選4.1本試驗(yàn)采用混料設(shè)計(jì),建立了各菌種在混合發(fā)酵劑中配比與發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物之間的回歸模型,分析得出乳酸的最大預(yù)測(cè)值為8.16g·L-1;丁二酮的最大預(yù)測(cè)值為77.23mg·L-1;乙醇的最大預(yù)測(cè)值為4259mg·L-1;二氧化碳的最大預(yù)測(cè)值為2.12g·L-1。4.2在單響應(yīng)值分析的基礎(chǔ)上,用軟件的最優(yōu)化功能(optimization)對(duì)滿足所有期望的響