純豆乳中益生菌發(fā)酵劑菌種篩選及菌種配比優(yōu)化

純豆乳中益生菌發(fā)酵劑菌種篩選及菌種配比優(yōu)化

病毒是指通過(guò)改善主要微生態(tài)平衡并對(duì)其進(jìn)行有益作用的微生物。益生菌的常見(jiàn)功能有維持腸道、生殖系統(tǒng)、皮膚等正常菌群,抗感染、輔助降低膽固醇、抑制癌細(xì)胞和增強(qiáng)免疫功能等。益生菌產(chǎn)品受到消費(fèi)者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)階段,益生菌發(fā)酵食品主要有發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品和發(fā)酵果蔬制品,其中益生菌酸乳已經(jīng)發(fā)展成為最典型、最成功的代表性功能食品。我國(guó)奶源不足,而且牛乳是動(dòng)物源食品原料,具有傳播人畜共患病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。大豆是豆科植物中最富有營(yíng)養(yǎng)而又易于消化的食物,是蛋白質(zhì)最豐富最廉價(jià)的來(lái)源。據(jù)報(bào)道,益生菌的發(fā)酵作用可將大豆中的大分子物質(zhì)降解,使其便于被人體吸收利用,還可以改善豆制品原有風(fēng)味。因此,發(fā)酵豆乳作為一種傳統(tǒng)豆制品與現(xiàn)代功能食品研究成果相結(jié)合的產(chǎn)物,日益受到人們的廣泛關(guān)注。但是,并非所有的益生菌都能應(yīng)用于發(fā)酵純豆乳的加工。目前,國(guó)內(nèi)外的研究者正積極從事于適宜純豆乳發(fā)酵的益生菌篩選與培育,以及應(yīng)用于發(fā)酵豆乳生產(chǎn)的高效穩(wěn)定發(fā)酵劑研發(fā)。本文通過(guò)對(duì)目標(biāo)菌株的馴化,篩選出能夠在豆乳中穩(wěn)定傳代且具有良好凝乳能力的益生菌。并在此基礎(chǔ)上,通過(guò)單純型格子點(diǎn)法混料試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)選出具有良好發(fā)酵風(fēng)味和產(chǎn)品形狀的發(fā)酵劑菌種比例。最后通過(guò)不同條件的培養(yǎng)試驗(yàn),確定了益生菌酸豆乳的最佳發(fā)酵條件。本研究為益生菌在發(fā)酵豆制品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù),為相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌種和培養(yǎng)基食用大豆、脫脂乳粉:市售;超純水:實(shí)驗(yàn)室制備;其他試劑均為分析純。鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、乳酸乳脂球菌(L.subsp.cremoris)、干酪乳桿菌(L.casei)、植物乳桿菌(L.plantarum):均由本研究室保藏。1.2培養(yǎng)基1.2.1基礎(chǔ)培訓(xùn)1.2.2原位脫脂乳粉與水的比例為1/9的脫脂乳A液:大豆與水的比例為1:12的熟豆?jié){;B液:脫脂乳粉與水的比例為1:9的復(fù)原脫脂乳;將A液與B液按一定比例充分混合,滅菌條件:112℃,15min。1.3空氣/蒸汽煮漿機(jī)XBLL-S01商用豆?jié){機(jī):上海帥佳電子科技有限公司;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SH-40蒸汽煮漿機(jī):廣東橞華機(jī)械設(shè)計(jì)有限公司;DHP120恒溫培養(yǎng)箱:上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;SP-2500pH計(jì):臺(tái)灣上泰有限公司。1.4測(cè)試方法1.4.1磨漿、煮漿條件大豆室溫浸泡12h,調(diào)整干豆與水的比例為1:12。使用豆?jié){機(jī)進(jìn)行磨漿,磨漿條件:轉(zhuǎn)速30000r/min,時(shí)間1min。使用蒸汽煮漿機(jī)進(jìn)行煮漿,煮漿條件:溫度100℃,時(shí)間5min。使用150目濾布濾去豆渣。1.4.2凝乳、傳代和接種挑取凍干菌粉接種于無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基中,分別按最適溫度進(jìn)行培養(yǎng),充分凝乳后進(jìn)行傳代,傳代2~3次,每次接種量3%,待菌種充分活化后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。1.4.3馴化培養(yǎng)基凝乳時(shí)間梯度增加馴化培養(yǎng)基熟豆?jié){(B液)的比例,對(duì)所有菌種進(jìn)行馴化培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37℃,每個(gè)梯度培養(yǎng)3代。馴化培養(yǎng)基中熟豆?jié){與復(fù)原脫脂乳之間的比例依次為:0:10、2:8、4:6、6:4、8:2、10:0。比較各個(gè)菌種接種的馴化培養(yǎng)基凝乳時(shí)間。馴化結(jié)束后,將全部菌種接種在熟豆?jié){中連續(xù)傳代6次,比較其凝乳效果,最終篩選出能夠在熟豆?jié){培養(yǎng)基中具有良好凝乳能力的菌種。1.4.4發(fā)酵劑菌種比例的確定將篩選菌種用作發(fā)酵酸豆乳發(fā)酵劑,運(yùn)用Minitab軟件,采用單純型格子點(diǎn)法對(duì)發(fā)酵劑中不同菌種的比例進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),比較凝乳時(shí)間和產(chǎn)品風(fēng)味,確定發(fā)酵劑最優(yōu)菌種比例。其中酸豆乳的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示,采用評(píng)分法,分?jǐn)?shù)高者為最優(yōu)結(jié)果。1.4.5酸豆乳發(fā)酵條件的確定1.4.5.影響發(fā)酵效果的因素試驗(yàn)研究以發(fā)酵豆乳充分凝乳時(shí)菌體數(shù)量的對(duì)數(shù)為優(yōu)化指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)研究發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響。將優(yōu)化后的發(fā)酵劑按3%接種量,分別在37、38、39、40、41、42℃環(huán)境下接種于熟豆?jié){中進(jìn)行培養(yǎng),待凝乳測(cè)定菌體密度。1.4.5.確定發(fā)酵劑接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響以發(fā)酵豆乳充分凝乳時(shí)菌體數(shù)量的對(duì)數(shù)為優(yōu)化指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)研究發(fā)酵劑接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響。將優(yōu)化后的發(fā)酵劑分別1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種于熟豆?jié){中在最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng),待充分凝乳后測(cè)定菌體密度。1.4.6計(jì)算細(xì)菌的方法采用平板菌落計(jì)數(shù)法,計(jì)數(shù)方法參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.35—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1菌種的選擇對(duì)最佳發(fā)酵條件的影響馴化結(jié)束后,菌種在熟豆?jié){中6次傳代情況,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,不同菌種在熟豆?jié){中凝乳能力不同。鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸乳脂球菌不能適應(yīng)100%熟豆?jié){這一生長(zhǎng)環(huán)境,無(wú)法在生產(chǎn)需要的時(shí)間內(nèi)凝乳。在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中隨著傳代次數(shù)的增加,接種了嗜酸乳桿菌和乳酸乳脂球菌的熟豆?jié){有不再凝乳的趨勢(shì);而兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌完全能夠適應(yīng)100%熟豆?jié){的發(fā)酵條件。兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌在熟豆?jié){中能夠穩(wěn)定傳代6次,而其他菌種在傳代1~4次后,便不能繼續(xù)穩(wěn)定傳代。2.2菌種配比確定應(yīng)用單純型格子點(diǎn)法設(shè)計(jì)發(fā)酵劑菌種比例,選用篩選出的兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌作為發(fā)酵劑的配方菌種進(jìn)行試驗(yàn)。接種不同配方發(fā)酵劑的熟豆?jié){的凝乳時(shí)間和感官評(píng)分結(jié)果如表3所示。接種不同配方發(fā)酵劑的熟豆?jié){的凝乳時(shí)間和感官評(píng)分等值線圖如圖1、圖2所示。由圖1可知,兩歧雙歧桿菌和植物乳桿菌對(duì)凝乳時(shí)間的影響呈現(xiàn)相似的趨勢(shì),凝乳時(shí)間較短的菌種配比主要集中于干酪乳桿菌占有相當(dāng)比例的范圍內(nèi)。由圖2可知,干酪乳桿菌是影響發(fā)酵豆乳感官評(píng)分的決定性因素,適當(dāng)降低干酪乳桿菌在復(fù)合發(fā)酵劑中的比例,可以一定程度上提高感官評(píng)價(jià)分值,即改善產(chǎn)品的風(fēng)味。本試驗(yàn)采用回歸方程Y=a1X1+a2X2+a3X3+a12X1X2+a13X1X3+a23X2X3+a123X1X2X3,其中,X1、X2、X3分別代表兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌,X1+X2+X3=1,0≤X1、X2、X3≤1。由表1結(jié)果,通過(guò)Minitab軟件,得到方程系數(shù)見(jiàn)表4。其中凝乳時(shí)間和感官評(píng)分回歸分析p值分別為0.007和0.004,均小于0.05,說(shuō)明回歸模型擬合良好。R-Sq值分別為90.51%和92.15%,均高于0.80,因此可以利用此模型對(duì)酸豆乳發(fā)酵劑的菌種配比進(jìn)行分析和優(yōu)化。對(duì)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化,在重要度感官評(píng)分高于凝乳時(shí)間的前提下,可以得到如下結(jié)果:菌種比例為兩歧雙歧桿菌41.9%、干酪乳桿菌26.8%、植物乳桿菌31.3%接種于熟豆?jié){中,可以在2.9h凝乳,感官評(píng)分達(dá)到8.2。據(jù)此進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),凝乳時(shí)間為3.0h,感官評(píng)分8分?；貧w方程得到的理論值與實(shí)際基本相符?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用,確定復(fù)合菌種發(fā)酵劑的菌種比例為兩歧雙歧桿菌40%、干酪乳桿菌30%、植物乳桿菌30%。2.3發(fā)酵方案的使用條件2.3.1發(fā)酵豆乳中乳清產(chǎn)出量的測(cè)定由表5數(shù)據(jù)可知,在發(fā)酵溫度為37~42℃的區(qū)間內(nèi),菌體密度先逐漸升高,然后逐漸降低,在40℃達(dá)到最大值9.47。在實(shí)際研究過(guò)程中發(fā)酵豆乳在40、41、42℃環(huán)境下培養(yǎng)有大量乳清析出,且乳清析出量隨溫度增加有遞增的趨勢(shì),所以不宜采用。在39℃和40℃環(huán)境下發(fā)酵豆乳中的菌體數(shù)量較高且差異較小,所以確定39℃為本研究?jī)?yōu)化的發(fā)酵劑在豆乳發(fā)酵中的最佳工作溫度。2.3.2益生菌豆乳最佳接種量的確定由表6數(shù)據(jù)可知,發(fā)酵豆乳中的菌體密度在接種量為1%~6%的區(qū)間內(nèi)逐漸升高,在接種量6%時(shí)達(dá)到最大值為9.84。結(jié)果顯示,接種量為3%~6%的區(qū)間內(nèi),菌體密度雖有增加,但變化量不大?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中的成本問(wèn)題,本研究采用接種量3%為益生菌豆乳的最佳發(fā)酵劑接種量。經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)后,將菌種配比為兩歧雙歧桿菌40%、干酪乳桿菌30%、植物乳桿菌30%的復(fù)合菌種發(fā)酵劑在39℃的溫度下,按接種量3%在帶渣全豆豆乳中進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵豆乳在2.8h凝乳,產(chǎn)品的感官評(píng)分為8分。3混料設(shè)計(jì)方法本研究發(fā)酵菌種篩選結(jié)果表明,不同益生菌菌種在豆乳中的生長(zhǎng)能力不同,也就是說(shuō)不是所有的益生菌都能應(yīng)用于發(fā)酵豆乳的生產(chǎn),優(yōu)化發(fā)酵豆乳生產(chǎn)用的益生菌發(fā)酵劑是十分必要的。Chou等用B.infantisCCRC14633進(jìn)行單菌發(fā)酵豆乳,發(fā)酵時(shí)間2d,菌落總數(shù)達(dá)到3.16×108cfu/mL。相關(guān)類似研究表明,單菌種發(fā)酵劑發(fā)酵豆乳操作簡(jiǎn)單易控制,但產(chǎn)品風(fēng)味、功能相對(duì)單一,且終產(chǎn)品生物量相對(duì)較低。Rossi從E.faeciumCRL183、L.acidophilus、S.thermophilus、L.jugurti和L.delbrueckiisspbulgaricus中,篩選出E.faeciumCRL183與L.jugurti混合發(fā)酵劑發(fā)酵豆乳,得到的產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特、發(fā)酵時(shí)間短、性狀穩(wěn)定。Wang等發(fā)現(xiàn),混合B.infantis、B.longum和L.bulgaricus作為復(fù)合菌種發(fā)酵劑時(shí)B.infantis和B.longum對(duì)L.bulgaricus的發(fā)酵作用有一定程度的抑制作用。這些研究結(jié)果表明,多菌種復(fù)合發(fā)酵豆乳時(shí),因發(fā)酵菌種種類不同,可能會(huì)互相促進(jìn)彼此間的發(fā)酵效果,豐富產(chǎn)品感官風(fēng)味,也可能相互抑制,不適于同時(shí)使用?；炝显囼?yàn)設(shè)計(jì)近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品、冶金、制藥等產(chǎn)業(yè)的配方研究中,可以有效控制試驗(yàn)次數(shù),通過(guò)回歸分析,得到原料比例與產(chǎn)品相關(guān)性能間的數(shù)量關(guān)系,從而選出較優(yōu)配方。周劍忠等,采用混料設(shè)計(jì)中的D-Optional方法,獲得由各種微囊化菌組成的混合發(fā)酵劑的配方為乳酸乳球菌(27%)、明串珠菌(37%)、開(kāi)菲爾乳桿菌(11%)、干酪乳桿菌(10%)、克魯維酵母(15%),并得出如下結(jié)論:混料設(shè)計(jì)和調(diào)優(yōu)軟件可用于混合發(fā)酵劑中多組分和多目標(biāo)參數(shù)優(yōu)化,獲得最優(yōu)的發(fā)酵劑組合。何秋實(shí)等采用混料設(shè)計(jì)中的單純型重心(SimplexCentroid)試驗(yàn)設(shè)計(jì),最終確定改變保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌3者的配比可得到不同性能的SPI凝膠。本研究以發(fā)酵豆乳的感官風(fēng)味和凝乳效率為指標(biāo),采用混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的單純型格子點(diǎn)法,同步優(yōu)化了適宜在純豆乳中應(yīng)用的單一菌種發(fā)酵劑與復(fù)合菌種發(fā)酵劑的益生菌配比,通過(guò)對(duì)發(fā)酵效果的比較和回歸方程分析,得到了與試驗(yàn)預(yù)期相符的結(jié)果。表明混料設(shè)計(jì)這種方法可以有效地應(yīng)用于多組分復(fù)合發(fā)酵劑的配方優(yōu)化。與其他學(xué)者的現(xiàn)有成果相比,在合理規(guī)范的前提下,大大減少了試驗(yàn)次數(shù)和研究周期。該方法適宜在以產(chǎn)品研發(fā)為目的的研究中應(yīng)用與推廣。4菌種比例及發(fā)酵溫度對(duì)益生菌發(fā)酵豆乳品質(zhì)的影響研究結(jié)果表明,兩歧雙歧桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌經(jīng)過(guò)馴化可以在純豆乳中連續(xù)傳代,發(fā)酵過(guò)程穩(wěn)定,凝乳效果明顯。通過(guò)單純型格子點(diǎn)法混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定發(fā)酵劑