用聚酰胺柱層析法制備egcg

用聚酰胺柱層析法制備egcg

中國(guó)擁有豐富的茶葉自然資源，以及幾千年的歷史。茶不僅具有提神解渴的功效,而且還富含具有保健、藥效功能的茶多酚(TeaPolyphenols)。茶多酚的抗腫瘤作用已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究人員的公認(rèn)。現(xiàn)代科學(xué)研究表明,茶多酚的主體化合物—兒茶素既是理想的天然抗氧化劑,又是一類極有價(jià)值的天然藥物原料,它的開發(fā)應(yīng)用前景十分美好。而兒茶素中含量最高的組分是EGCG(L-表沒食子兒茶素沒食子酸酯,Epigallocatechingallate),具有酚類抗氧化劑的通用性,同時(shí),因其結(jié)構(gòu)中有6個(gè)鄰位酚羥基而有優(yōu)于其他兒茶素的許多性質(zhì)。由于兒茶素單體在結(jié)構(gòu)上的相似性,要想從商品茶多酚中制備兒茶素單體是一件非常困難的事情,所以長(zhǎng)期以來,兒茶素單體的價(jià)格居高不下,這對(duì)它的應(yīng)用帶來不利影響,也使近年來人們對(duì)兒茶素單體的分離研究越來越關(guān)注。根據(jù)初步研究和文獻(xiàn)資料,發(fā)現(xiàn)用柱層析分離兒茶素單體是一條比較好的工藝路線,尤其是聚酰胺柱層析和硅膠柱層析的聯(lián)合使用,具有獨(dú)特的優(yōu)越性。本試驗(yàn)以商品茶多酚為原料,對(duì)聚酰胺、硅膠二次柱層析制備高純度EGCG的工藝條件進(jìn)行了探索。1材料和方法1.1色譜、儀器和儀器高效液相色譜泵:Waters515型,美國(guó)Waters公司;柱溫箱:CBLModel100型,美國(guó)PhotoelectronTechnology公司;雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器:Waters2487,美國(guó)Waters公司;色譜工作站:ChromStation,美國(guó)Sage公司;注射器:Hamilton25μL,美國(guó)Hamilton公司;旋光儀:AutopolIV型,美國(guó)RUDOLPH公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮。玻璃層析柱規(guī)格500mm×20mm:定制;聚酰胺粒徑:150～75μm,江蘇臨江試劑化工廠;硅膠粒徑:48～38μm,青島海洋化工廠;乙醇、甲醇:層析,工業(yè)品;石油醚、乙酸乙酯、甲酸:分析純;水:層析,蒸餾水,重蒸餾水;乙腈:色譜純,四川航嘉生物科技有限責(zé)任公司;乙酸乙酯:色譜純;EGCG標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司。1.2流動(dòng)相的檢測(cè)將EGCG標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.2,0.4,0.8,1.0,1.2,1.4mg/mL等一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后,對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。以HPLC檢測(cè)的峰面積Y為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)線性方程如下:Y=3.0×106X-35823式中:Y——峰面積;X——EGCG的質(zhì)量濃度,mg/mL;方程的線性相關(guān)系數(shù)為0.9998。色譜條件:VP-ODS(250L×4.6)(SHMADZU);以(H2O)∶(CH3CN)∶(CH3COOCH2CH3)=86∶12∶2的混合溶劑作為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;柱溫30℃;流速為1mL/min。將收集的餾分液,用HPLC法測(cè)定峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)線性方程計(jì)算餾分液中茶多酚中EGCG的含量。1.3洗脫溶劑與聚酰胺體系將一定量的聚酰胺置于一定量的甲醇中加熱回流2h,過濾,濾餅用洗脫劑為甲醇∶水=4∶1(V∶V)洗3次,濾液中甲醇回收重復(fù)使用。再向聚酰胺中加入一定量的洗脫劑浸泡過夜。將用洗脫劑浸泡處理好的聚酰胺細(xì)粉用超聲波除去氣泡后,倒入層析柱中,使聚酰胺自然沉降,放出柱內(nèi)多余的洗脫劑,至液面略高于聚酰胺粉表面時(shí)關(guān)閉活塞,待用。1.4使“三維”以活化硅材料為原料生產(chǎn)的模具將硅膠在110℃溫度下,烘2h,除去吸附的水分,使硅膠活化。活化好的硅膠用洗脫劑浸泡,超聲波除去氣泡后,裝入層析柱中,使硅膠自然沉降,放出柱內(nèi)多余的洗脫劑,至液面略高于硅膠表面時(shí)關(guān)閉活塞,備用。1.5分離的準(zhǔn)備1.5.1樣品的制備和洗脫選用柱徑20mm,有效柱長(zhǎng)400～450mm,洗脫劑為甲醇∶水=4∶1(V∶V),在pH值為4.5,溫度為25℃(室溫)時(shí),選用粒徑150～75μm的聚酰胺,洗脫劑流速為4.0mL/min的情況下等度洗脫為層析條件,準(zhǔn)確稱取一定量商品茶多酚,溶于洗脫劑(甲醇和水的混合溶液)中,配成0.3g/mL的溶液,加入到聚酰胺層析柱中分離,分餾分收集,每份5mL,用HPLC檢測(cè)至洗脫完全。收集兒茶素單體EGCG純度達(dá)成85%的流出液,供后續(xù)試驗(yàn)使用。1.5.2乙酸乙酯的制備首先將聚酰胺層析柱分離得到的兒茶素單體EGCG溶液,旋蒸濃縮,加酸調(diào)節(jié)pH=4.5,用乙酸乙酯以1∶1(V∶V)在室溫下萃取3次,合并萃取液,減壓濃縮,回收乙酸乙酯,濃縮到兒茶素的濃度為400mg/mL左右,備用。1.5.3ecgg-g-mu層析柱的制備將用聚酰胺層析柱層析得到的EGCG純度達(dá)85%以上的產(chǎn)品作為原料,加入柱徑為2.50mm,有效柱長(zhǎng)400mm的硅膠(48～38μm)層析柱中,洗脫劑為乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸體積比為6∶7∶1(V∶V),在pH值為4.5,溫度為25℃下過柱,分段收集流出液,將含EGCG純度98%以上的餾分合并,濃縮并回收溶劑,冷凍干燥得產(chǎn)品:EGCG的純度達(dá)98%以上。2結(jié)果與討論2.1采用二次柱層析工藝使用各種不同等級(jí)的商品茶多酚為原料,先用聚酰胺柱層析預(yù)分離EGCG,然后再用硅膠柱層析制備EGCG的效果,如表1所示。茶多酚的質(zhì)量受茶葉原料的影響,商品茶多酚的品質(zhì)是不同的,由于這里采用的是二次柱層析工藝,所以對(duì)初始原料的要求較低。從表1可見,只需用茶多酚TP含量70%以上的原料,就可經(jīng)聚酰胺柱層析得到含85%以上兒茶素單體EGCG的硅膠柱層析的原料。使用這個(gè)工藝可以用較低質(zhì)量的商品茶多酚生產(chǎn)98%以上高純度的兒茶素單體EGCG產(chǎn)品,可大大地降低生產(chǎn)成本,有望實(shí)現(xiàn)低成本的工業(yè)化生產(chǎn)。2.2復(fù)合柱層析分離效果的影響因素在工藝條件不變的情況下,硅膠層析柱的重復(fù)使用效果,如表2所示。從表2可見,使用后的硅膠層析柱,經(jīng)乙酸乙酯洗除被硅膠強(qiáng)烈吸附的雜質(zhì),再用石油醚平衡后,硅膠柱可重復(fù)使用,但使用次數(shù)一般3次,如果超過3次后,分離效果明顯下降。分析其原因主要有兩方面:一方面是使用的原料是先經(jīng)聚酰胺柱層析預(yù)處理過的,含有微量的水分,會(huì)降低硅膠柱的層析效果;另一方面是用乙酸乙酯洗滌硅膠柱,不可能將硅膠所吸附的雜質(zhì)洗滌完全,經(jīng)多次積累,也會(huì)降低硅膠柱的層析效果。3聚酰胺ecgg為原料用商品茶多酚為原料,先用聚酰胺柱層析預(yù)分離EGCG,隨后再用硅膠柱層析精制制備高純度的EGCG。采用此工藝條件,可用較低等級(jí)的商品茶多酚(70%TP)為原料,制備高純度的EGCG,純度達(dá)98%以上。由于聚酰胺能夠多次使用,并且在預(yù)分離茶多酚兒茶素的時(shí)候,富集的兒茶素幾乎全是EGCG、GCG、ECG,