項目5：微生物分離純化技術(shù)

食品微生物技術(shù)項目：微生物分離與純化技術(shù)目錄CONTENTS1微生物生長與控制3菌種保藏2菌種分離、純化技術(shù)重點：微生物生長曲線及特點微生物分離純化方法難點：微生物生長量測定方法及原理學習目的：了解分離純化的目的意義；

掌握分離純化的技能操作。微生物生長與控制1

什么是生長？1、微生物生長定義生物個體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導致個體體積擴大的生物學過程。生長：生物個體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學過程。繁殖：生長是一個逐步發(fā)生的量變過程，繁殖是一個產(chǎn)生新的生命個體的質(zhì)變過程。1、微生物生長定義一個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行代謝個體的生長原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾尤绻骷毎M分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，引起個體數(shù)目的增加。群體內(nèi)各個個體的進一步生長群體的生長1、微生物生長定義微生物生長:在微生物學中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點與研究大生物時有所不同。群體生長=個體生長+個體繁殖個體生長→個體繁殖→群體生長1、微生物生長定義目的：考察單位時間微生物數(shù)量或生物量的變化。微生物生長量的測定：個體計數(shù)群體重量測定群體生理指標測定2、微生物生長量的測定工具：顯微鏡、血球計數(shù)板方法：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量，對微生物數(shù)量進行直接計數(shù)。1、顯微鏡直接計數(shù)法（一）以數(shù)量變化進行測定2、微生物生長量的測定顯微鏡直接計數(shù)法該方法特點：快速；結(jié)果不準確不能區(qū)分死菌與活菌不適于對運動細菌的計數(shù)需要相對高的細菌濃度個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察2、微生物生長量的測定注意：一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，

CFU）來表示，而不是直接表示為細胞數(shù)。通常用來測定細菌、酵母菌等單細胞微生物的生長情況；還可測定樣品中所含微生物個體的數(shù)量。2、平板培養(yǎng)計數(shù)法（平板菌落計數(shù)）（一）以數(shù)量變化進行測定2、微生物生長量的測定（一）以數(shù)量變化進行測定

平板培養(yǎng)計數(shù)法（平板菌落計數(shù)）特點：

耗時；結(jié)果相對準確；屬于活菌計數(shù)，有一定的實際指導意義。2、微生物生長量的測定

對平板計數(shù)法結(jié)果的影響：01020304操作要求：無菌、熟練、準確樣品要充分混勻?qū)９軐Ｓ茫恐б埔汗苤荒芙佑|一個稀釋度的菌液）同一稀釋度平行兩個或三個2、微生物生長量的測定（二）以生物量為指標測定微生物生長1、重量法以干重直接衡量微生物群體的生物量；通過測定樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量，間接推算微生物群體的生物量。測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法2、微生物生長量的測定2、比濁法（二）以生物量為指標測定微生物生長在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(O.D.)表示菌量。實驗測量時應控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確。2、微生物生長量的測定微生物的特點：個體微小肉眼看到的微生物是成千上萬個單個微生物組成的群體。微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。對微生物群體生長規(guī)律的了解是對其進行研究與利用的基礎(chǔ)。2、微生物生長量的測定同步培養(yǎng)技術(shù)：

設(shè)法使群體中的所有細胞，盡可能都處于同樣細胞生長和分裂周期中，然后分析此群體的各種生物化學特征，從而了解單個細胞所產(chǎn)生的變化。同步生長方法：1、環(huán)境條件誘導2、物理方法從隨機的、不同步細菌群體選擇出同步的群體3、微生物生長的控制-同步培養(yǎng)同步培養(yǎng)：使群體中的細胞處于比較一致的，生長發(fā)育均處于同一階段上，即大多數(shù)細胞能同時進行生長或分裂的培養(yǎng)方法。以同步培養(yǎng)方法使群體細胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長。同步生長：通過同步培養(yǎng)方法獲得的細胞被稱為同步細胞或同步培養(yǎng)物。3、微生物生長的控制-同步培養(yǎng)

同步培養(yǎng)物應用：

（1）常被用來研究在單個細胞上難以研究的生理與遺傳特性；（2）作為工業(yè)發(fā)酵的種子，它是一種理想的材料。

機械方法離心方法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法環(huán)境條件控制技術(shù)溫度培養(yǎng)基成份控制其他（光照和黑暗交替培養(yǎng)）3、微生物生長的控制-同步培養(yǎng)生長曲線(GrowthCurve)定義細菌接種到定量培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫座標，以菌數(shù)為縱座標作圖，得到的一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。均指群體生長3、微生物生長曲線生長曲線(GrowthCurve)一條典型的生長曲線可分為：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等四個生長時期。3、微生物生長曲線遲緩期也稱延遲期、適應期。在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。3、微生物生長曲線分裂遲緩、代謝活躍遲緩期特點：遲緩期出現(xiàn)的原因：調(diào)整代謝在生產(chǎn)實踐中縮短遲緩期的常用手段：(1)通過遺傳學方法改變菌種的遺傳特性；(2)利用對數(shù)生長期的細胞作為種子；(3)盡量使接種前后所用培養(yǎng)基組成不要相差太大；(4)適當擴大接種量。3、微生物生長曲線生長曲線(GrowthCurve)以最大的速率生長和分裂，細菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，數(shù)量呈對數(shù)增加。對數(shù)期3、微生物生長曲線在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間為代時(Generationtime)，代時通常以G表示。在群體生長里細菌數(shù)量增加一倍所需的時間稱為倍增時間（Doublingtime)。對數(shù)期有關(guān)概念：影響代時的原因：

菌種；營養(yǎng)成分；營養(yǎng)物濃度；溫度。3、微生物生長曲線生長曲線(GrowthCurve)定義穩(wěn)定生長期又稱恒定期或最高生長期，此時培養(yǎng)液中活細菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。（即細菌分裂增加的數(shù)量等于細菌死亡數(shù)）3、微生物生長曲線生長曲線(GrowthCurve)定義衰亡期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率超過新生速率，呈現(xiàn)出負增長，但仍有部分活菌存在。3、微生物生長曲線微生物生長曲線小結(jié)微生物生長曲在發(fā)酵中的應用有哪些？

思考連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng)基本原則：培養(yǎng)過程中不斷補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物。4、微生物生長的控制-連續(xù)培養(yǎng)控制連續(xù)培養(yǎng)的方法恒濁連續(xù)培養(yǎng)不斷調(diào)節(jié)流速而使細菌培養(yǎng)液濁度保持恒定恒化連續(xù)培養(yǎng)保持恒定的流速4、微生物生長的控制-連續(xù)培養(yǎng)（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng)測定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出的流速使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度控制措施：當培養(yǎng)室中的濁度超過預期數(shù)值時：流速加快，使?jié)岫冉档?；當培養(yǎng)室中的濁度低于預期數(shù)值時：流速減慢，使?jié)岫壬?。恒濁培養(yǎng)器的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定。4、微生物生長的控制-連續(xù)培養(yǎng)（二）恒化連續(xù)培養(yǎng)使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下進行生長繁殖。4、微生物生長的控制-連續(xù)培養(yǎng)菌種分離、純化技術(shù)2菌種分離、純化1、有關(guān)概念將特定的微生物個體從群體中或從混雜的微生物群體中分離出來的技術(shù)叫作分離。分離純化在特定環(huán)境中讓一種來自同一父輩的微生物群體生存的技術(shù)叫作純化。分離后的微生物要進行純培養(yǎng)；分離技術(shù)主要是：稀釋和選擇培養(yǎng)。2、自然界中菌種分離方法步驟采樣增殖培養(yǎng)純種分離純培養(yǎng)生產(chǎn)性能測定菌種分離、純化思考1、微生物分離純化可分為菌落純和細胞純，查閱資料如何操作？2、微生物分離的常用方法有哪些?

菌種保藏3菌種保藏為何要對菌種進行保藏？菌種的衰退；供下次培養(yǎng)使用。1、有關(guān)概念衰退（degeneration）：在微生物的生長過程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負變，即菌種的衰退。復壯(rejuvenation)：狹義的復壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施；廣義的復壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。菌種保藏2、防止菌種衰退的方法控制傳代的次數(shù)采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù)。創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件利用不同類型的細胞進行接種傳代

對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進行接種。采用有效的菌種保藏方法菌種保藏3、菌種的復壯措施純種分離

菌落純的分離方法（平板表面涂布法，平板劃線分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法）

細胞純的分離方法（分離小室進行單細胞分離，顯微操縱器進行單細胞分離，菌絲尖端切割法進行單細胞分離）通過宿主體內(nèi)生長進行復壯（如寄生微生物的復壯）淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）菌種保藏菌種保藏菌種保藏的原理：挑選典型菌種的優(yōu)良純種一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等）創(chuàng)造適于微生物長時期休眠的環(huán)境條件（如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸堿中和劑等）菌種保藏常用菌種保藏方法方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法*沙土保藏法真空冷