異育銀鯽雄核發(fā)育的遺傳多態(tài)性

異育銀鯽雄核發(fā)育的遺傳多態(tài)性

堅(jiān)果發(fā)育是指使用精子生產(chǎn)只連接父系遺傳物質(zhì)的個(gè)體的繁殖方法。雄核發(fā)育的繁殖方式恰好與雌核發(fā)育(Gynogenesis)的繁殖方式相反,顯得更為特殊和罕見。就魚類的雄核發(fā)育而言,大多數(shù)是人工誘導(dǎo)產(chǎn)生,如用γ、χ射線或紫外線(UV)破壞卵子DNA的活性后,與正常單倍體精子授精,然后再用溫度休克或靜水壓處理抑制合子第一次卵裂,使單倍體的合子二倍化。此外,也可用熱休克(或靜水壓)處理后產(chǎn)生四倍體或天然四倍體雄魚產(chǎn)生的二倍體精子和DNA已無(wú)活性的卵子結(jié)合。直至目前,人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育仍是較新的技術(shù),在選種、保種和育種方面都顯示出它的價(jià)值,但還沒有在商業(yè)生產(chǎn)上使用。然而,我們?cè)?991年用鯽(Carassiusauratus)卵與天然雌核發(fā)育異育銀鯽精子進(jìn)行人工授精、孵化率約5%~8%的子代中,意外地發(fā)現(xiàn)有5%左右的雄核發(fā)育個(gè)體。它們不但能存活、性成熟和產(chǎn)卵,并能與其父本精子受精,產(chǎn)生十分正常的魚苗、魚種。與此同時(shí),我們將它們初步應(yīng)用到生產(chǎn)單位飼養(yǎng)。因此,本研究的初步結(jié)果可為魚類遺傳育種工作提供參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)池n鯽(Carassiusauratus)產(chǎn)自上海青浦縣淀山湖,染色體數(shù)目為2n=100;興國(guó)紅鯉(Cyprinuscarpioredvariety)原產(chǎn)江西省興國(guó)縣,現(xiàn)取自本所試驗(yàn)池;異育銀鯽為中科院水生生物研究所于1981年惠贈(zèng)的夏花魚種在上海繁衍的后裔,體色為銀灰黑色,染色體數(shù)目為3n=156。1.2采用br-2顯微觀察主要形態(tài)特征按常規(guī)方法測(cè)量魚的各個(gè)部位,色素細(xì)胞形態(tài)的觀察是沿側(cè)線取下第10片的側(cè)線上鱗,置載玻片上加少許水,在OlympusBH-2顯微鏡下觀察和照相。細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)部分按樓允東等的方法。1.3繁殖與擴(kuò)大雜交1991~1995年,在青浦縣西岑、蓮盛的本所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行人工繁殖和魚苗魚種培育。雜交組合為:鯽(♀)×異育銀鯽(♂)→F1?F1(♂)→F1?F1(似父本者♀)×異育銀鯽♂→B1♂→B1。B1魚種供少數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)。1.4pcr擴(kuò)增與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)解剖活魚后,立即取出其肝臟,液氮凍存。然后,分別進(jìn)行基因組DNA的提取,并進(jìn)行RAPD檢測(cè)。150個(gè)RAPD擴(kuò)增用隨機(jī)序列寡核苷酸引物(10nt,0.5OD/0.5mL)購(gòu)自浙江省博聯(lián)營(yíng)養(yǎng)與工程科學(xué)研究所生命技術(shù)中心。PCR擴(kuò)增儀為上海復(fù)日生物技術(shù)公司生產(chǎn)的FR-800型擴(kuò)增儀。耐高溫DNA聚合酶為復(fù)華實(shí)業(yè)公司生物技術(shù)部提供的FD-Taq酶,4U/μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是參照Willams等的方法進(jìn)行。最后取10~20μL的擴(kuò)增產(chǎn)物,用2%~3%含EB的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),紫外燈下觀察、照相。2結(jié)果2.1東果梨酒的產(chǎn)卵當(dāng)鯽卵與異育銀鯽(3n=156)精子人工授精時(shí),受精率可達(dá)80.4%~87.1%,但孵化率只有5%~8%。將仔魚飼養(yǎng)成體重約25g的魚種時(shí),約有5%的魚種體色呈銀灰黑色,酷似父本異育銀鯽,簡(jiǎn)稱F1(下同)。魚種飼養(yǎng)至翌年4月,5尾魚的卵巢成熟系數(shù)平均為11.58%(體長(zhǎng)19.8~20.0cm、體重303~324g)。群體中亦有少量雄魚(♀∶♂=153∶17)(♀∶♂=153∶17),且達(dá)性成熟。雌魚的懷卵量,平均每尾37038粒。達(dá)性成熟的雌魚經(jīng)催情后,排出的卵子淡灰黃色,呈圓球形,粘性,每克卵子約含1610粒。卵與父本精子回交的受精率為76.8%~87.1%,平均為83.2%,平均孵化率為86.4%(85.3%~87.4%),孵出的仔魚簡(jiǎn)稱為B1(下同)。2.2其它可數(shù)性狀F1與其親本(鯽、異育銀鯽)或與B1,在主要形態(tài)性狀方面均屬低-中背型的體型,體高/體長(zhǎng)(%)依次為:38.74±0.66、38.08±1.19、37.10±0.50、38.60±0.39,其它可數(shù)性狀也比較接近。惟有體色可把鯽、異育銀鯽(包括F1、B1)很容易區(qū)分開來,因?yàn)轹a的體色大多數(shù)呈淡灰黃黑色,而異育銀鯽、F1和B1的體色則呈銀灰黑色。究其原因,可能與黃色素、黑色素細(xì)胞等分布及組合不同有關(guān)。淀山湖的野生鯽鱗片后區(qū)有較多黃色素粒,黑色素細(xì)胞的黑色素略呈不規(guī)則的放射狀分散地分布(圖版-1)。而異育銀鯽(3n=156)及F1似父本異育銀鯽鱗片后區(qū)的黃色素粒相對(duì)地少一些,黑色素細(xì)胞的黑色素多數(shù)呈較規(guī)則的放射狀分布,形似菊花(圖版-2,3)。B1的黑色素細(xì)胞的黑色素及黃色素粒的分布則似親本。2.3與魚類規(guī)格混養(yǎng)試驗(yàn)期間,F1(似異育銀鯽者)與父本回交的子代B1共生產(chǎn)了約120萬(wàn)的夏花及體重約10~50g的魚種,分別在一些水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)和個(gè)體養(yǎng)殖戶進(jìn)行推廣試養(yǎng)。1994年6月20日,我們將15000尾夏花魚種放養(yǎng)在一口5332.8m2成魚池與草、鰱、鳙、團(tuán)頭魴、異育銀鯽(徐涇鄉(xiāng)生產(chǎn)的)大規(guī)格魚種(體重為41.7~750g)混養(yǎng),至年底干池起捕,獲89%的成活率,平均每尾規(guī)格達(dá)50g,占全池成魚總產(chǎn)量的15.29%。這些規(guī)格比較一致的魚種于1995年1月20日又放養(yǎng)在一口666.6m2的成魚池中,再與草魚(71.4~900g/尾)、白鰱(200~450g/尾)、鳙(200~450g/尾)、團(tuán)頭魴(200g/尾)和B1夏花魚種混養(yǎng)。至12月24日干塘起捕時(shí),原B1魚種體重平均達(dá)180g/尾,成活率達(dá)92%,占全池總產(chǎn)量(13220.5kg)的25.05%。而同池混養(yǎng)的B1夏花魚種,其平均每尾體重達(dá)45.5g,成活率達(dá)90%的,占全池塘總產(chǎn)量的6.19%。假如混養(yǎng)的其它魚種規(guī)格小一些,可能會(huì)更有利于B1的生長(zhǎng)。此外,B1的生長(zhǎng)是屬于勻速生長(zhǎng)的類型,其體重W和體長(zhǎng)L呈冪函數(shù)增長(zhǎng),相關(guān)式為W=aLb,W=0.04128L3.01206。2.4異育銀蚤及其細(xì)胞的大小紅血細(xì)胞:異育銀鯽、似父本的F1及B1的紅血細(xì)胞核大小較相似(圖版—4,5),它們的核體積各為鯽(圖版-6)的1.6倍。肝細(xì)胞:異育銀鯽、F1及B1的肝細(xì)胞較大,長(zhǎng)軸各約46μm,而鯽肝細(xì)胞的長(zhǎng)軸只27μm左右(圖版—7,8,9)。染色體數(shù)目:似父本的F1、B1腎細(xì)胞的染色體數(shù)目與父本異育銀鯽均各具有3n=156的數(shù)目(圖版—10,11,12)。2.5rapd多態(tài)性片段的擴(kuò)增引物篩選:篩選了150個(gè)隨機(jī)引物(10nt),發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的引物可擴(kuò)增出2~14條DNA片段,絕大部分?jǐn)U增片段的大小在300~2500bp之間。在150個(gè)引物中有9個(gè)引物(A15,B19,B20,C9,F9,G3,G15,I4,I16)可以擴(kuò)增出36個(gè)具多態(tài)性的DNA片段用來作為分子標(biāo)記。圖版—13、圖版—14為其中2個(gè)引物B20和A15分別擴(kuò)增的圖譜。RAPD多態(tài)性條帶的分布:在母本鯽、父本異育銀鯽及其雜交F1(似父本者)、F1與父本回交B1的RAPD圖譜進(jìn)行比較時(shí),可以發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)擴(kuò)增帶型完全相同的情況下,存在1~6條多態(tài)性片段表現(xiàn)為“有無(wú)”或“位置”多態(tài)。在36個(gè)多態(tài)性標(biāo)記中,22條帶屬父本顯性標(biāo)記(母本為隱性純合子)均遺傳給F1,部分條帶在回交B1中發(fā)生了分離。母本鯽的14條顯性標(biāo)記條帶,均不遺傳給F1或B1。似乎子代受了父本異育銀鯽的顯性控制,因而無(wú)法表現(xiàn)母本性狀標(biāo)記。另外,有3條父本異育銀鯽的顯性RAPD標(biāo)記同時(shí)出現(xiàn)于紅鯉的擴(kuò)增帶中,這表明異育銀鯽基因組中很可能摻入了紅鯉的遺傳信息。3天然魚類的遺傳穩(wěn)定性在自然界中,雌核發(fā)育是動(dòng)物界一種少有的有性繁殖方式,方正銀鯽就屬其中之一。它與興國(guó)紅鯉人工授精產(chǎn)生的異育銀鯽,也繼承了母本雌核發(fā)育的特性。然而,魚類雌核發(fā)育作為一種特化的繁殖適應(yīng)機(jī)制,它的進(jìn)化地位與有性繁殖和孤雌生殖保持聯(lián)系。因此,雌核發(fā)育機(jī)制只具有相對(duì)的穩(wěn)定性。由于此因,當(dāng)雌核發(fā)育銀鯽或異育銀鯽與鯉科等魚類婚配的子代中,出現(xiàn)很少一部分的雜交種或雄核發(fā)育的個(gè)體是不可避免的,這是由于雌核發(fā)育只具有相對(duì)的穩(wěn)定性所致。人工誘導(dǎo)獲得酷似母本的異育銀鯽四倍體雜種和具有一整套父本紅鯉染色體的復(fù)合四倍體異育銀鯽(出現(xiàn)率僅0.2%)便是例證。后來,丁軍等觀察到復(fù)合四倍體異育銀鯽產(chǎn)生時(shí),各有0.33%的受精卵發(fā)生了兩性融合或兩性接合發(fā)育,他們進(jìn)而推論銀鯽卵的雌核發(fā)育控制系統(tǒng)很可能是由一個(gè)可以開啟和關(guān)閉的基因操縱系統(tǒng)控制的,所以,銀鯽雌核發(fā)育只具有相對(duì)的穩(wěn)定性。在自然界中,迄今尚未有真正天然雄核發(fā)育的魚類及其應(yīng)用報(bào)道?？墒菍?shí)際上,在魚類的遠(yuǎn)緣雜交中,雄核發(fā)育的現(xiàn)象確實(shí)存在。不過,常為人們所忽視。如在鯉(♀)×草魚(♂)(♂)雜交中獲得了雄核發(fā)育二倍體草魚。在紅鯽(♀)×草魚(♂)(♂)的雜交中也發(fā)現(xiàn)過草魚雄核發(fā)育的單倍體胚胎。四川南充縣于1981年12月在興國(guó)紅鯉(♀)和草魚(♂)(♂)的雜交F1代中,分別發(fā)現(xiàn)3尾紅草魚,其中2尾體重分別為2.1kg和5kg。在1985年進(jìn)行異育銀鯽(♀)×興國(guó)紅鯉(♂)(♂)人工授精中,獲得占0.61%的雜交種,其中1尾無(wú)須鯉性成熟后產(chǎn)卵與鯽(♂)(♂)雜交時(shí),獲得了大量正常的鯉鯽雜交種,有的水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)后反映良好。此外,單仕新等也報(bào)道在三倍體方正銀鯽(♂)(♂)同二倍體紅鯽(♀)雜交中,獲得2尾室內(nèi)飼養(yǎng)至4cm左右、體色青灰色的鯽魚。因他們對(duì)2尾鯽魚沒有進(jìn)行遺傳背景的分析,故不能排除雄核發(fā)育的可能性。李傳武等從10萬(wàn)個(gè)以草魚精子受精的鯉魚卵中得到了1尾能正常存活的“草魚型雜種”,經(jīng)形態(tài)和染色體組型測(cè)定,證實(shí)為雄核發(fā)育二倍體草魚。許多魚類的育種實(shí)踐表明,經(jīng)濟(jì)雜交時(shí)兩種雜交類型是可能的:①將雌核發(fā)育雌魚與非親緣的遠(yuǎn)緣雄魚雜交(一種‘頂交’);②兩種近親親魚的雜交。如果獲得雄核發(fā)育(只有父本遺傳性狀的魚類后代),第二種方式是可能的。至此,我們推測(cè)營(yíng)獨(dú)特的天然雌核發(fā)育生殖背景的異育銀鯽,其部分精子在既脫離了卵質(zhì)的抑制作用,同時(shí)又得益于近親鯽(鯽屬中的不同亞種)相似的遺傳背景的特殊條件,故很可能受到雌核發(fā)育調(diào)控系統(tǒng)和兩性生殖調(diào)控系統(tǒng)的雙重影響,其結(jié)果表現(xiàn)出一定比例(約5%)的F1只接受父本遺傳的雄核發(fā)育。這一現(xiàn)象,可以圓滿地解釋為什么父本顯性RAPD標(biāo)記在子一代中表現(xiàn)父本遺傳而不分離,而母本顯性RAPD標(biāo)記則不出現(xiàn)。在回交B1中,父本顯性的RAPD標(biāo)記出現(xiàn)了分離,這正是兩性融合生殖的產(chǎn)物。此外,在提供RAPD標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證據(jù)的同時(shí),結(jié)合根據(jù)對(duì)親本和子代間的相似系數(shù)分析、聚類分析結(jié)果,以及有關(guān)細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的研究結(jié)果,它們基本上是一致的。因此,以