全蝎-蜈蚣藥對哮喘模型大鼠氣道重塑及氣道炎癥的影響

全蝎-蜈蚣藥對哮喘模型大鼠氣道重塑及氣道炎癥的影響

氣管哮喘是一種由各種細(xì)胞，尤其是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和t淋巴結(jié)引起的慢性呼吸道性炎癥性疾病。氣道重塑(airwayremodeling)是哮喘重要的病理生理特征之一,是產(chǎn)生持續(xù)性的氣道高反應(yīng)性和不可逆性氣流阻塞的主要病理基礎(chǔ),早期抑制氣道重塑被認(rèn)為是支氣管哮喘干預(yù)的新靶點。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的有效藥物,但能否有效抑制氣道重塑尚存在爭議。祖國醫(yī)學(xué)中針對難治性哮喘患者多用全蝎、蜈蚣、地龍等具搜風(fēng)通絡(luò)功效的蟲類藥物,其中全蝎-蜈蚣為其中的驗方藥對,取其祛風(fēng)通絡(luò)、活血祛瘀之效,臨證應(yīng)用中多獲良效。本實驗旨在研究“全蝎-蜈蚣”對哮喘模型大鼠氣道炎癥及氣道重塑的作用,進一步探討其可能的作用機制,為該藥對在哮喘治療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。1材料表面1.1動物1.2全蟹原螯蝦種,6.5g/袋,5.5g/袋;卵白蛋白(OVA,美國Sigma公司產(chǎn)品),10%氫氧化鋁佐劑(上海化學(xué)試劑有限公司),全蝎-蜈蚣藥對[全蝎顆粒劑(0.5g/袋,批號1101144,相當(dāng)于全蝎原生藥材3g),蜈蚣顆粒劑(0.5g/袋,批號1011060,相當(dāng)于蜈蚣原生藥材1條),均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供]。全蝎-蜈蚣藥對以1∶1配比,將全蝎顆粒劑1袋+蜈蚣顆粒劑1袋,加入96mL蒸餾水浸泡30min,使其充分溶解,調(diào)整藥物質(zhì)量濃度至62.5g·L-1,于4℃保存?zhèn)溆谩?.3儀器魚躍403C型霧化器(江蘇醫(yī)療設(shè)備有限公司),LeciaQwinV3圖像分析軟件、Lecia正置三目顯微鏡(均為德國徠卡公司)。2方法2.1哮喘模型的制備2.2全蟹-瞳的檢測各組自第15天起于每日激發(fā)前1hig給藥,每日ig1次,連續(xù)3周,正常組和模型組第15~43天以生理鹽水10mL·kg-1ig,全蝎-蜈蚣組第15~43天予全蝎-蜈蚣藥液以0.625g·kg-1ig。大鼠給藥劑量參照《中藥藥理實驗方法學(xué)》人與動物間按體表面積折算的等效劑量折算。2.3balp細(xì)胞分離各組大鼠均在末次激發(fā)后24h內(nèi)處死,打開胸腔及頸部組織,結(jié)扎左側(cè)主支氣管,行氣管插管,4mL生理鹽水行支氣管肺泡灌洗,重復(fù)2次,回抽量5~6mL。將回收過濾后的BALF,4000r·min-1離心10min后取沉淀細(xì)胞,用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,調(diào)整液體為20μL,置以4℃保存,在顯微鏡下行細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類計數(shù);經(jīng)肺動脈插管灌注4%多聚甲醛-PBS固定肺組織,取左肺組織標(biāo)本浸泡在多聚甲醛PBS中24h固定,備用于病理檢測。2.4觀察指標(biāo)2.4.1一般狀況觀察2.4.2細(xì)胞活動比的確定BALF中細(xì)胞總數(shù)計數(shù):取BALF細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計數(shù)板后在40×10倍高倍鏡下計數(shù)。細(xì)胞總數(shù)=4個大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)之和/4×稀釋倍數(shù)×104/mLBALF中細(xì)胞分類:取BALF細(xì)胞懸液涂片,行HE染色后,100×10倍油鏡進行細(xì)胞分類計數(shù),計算嗜酸粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的百分比(選取細(xì)胞分布較均勻的高倍視野,數(shù)200個細(xì)胞計算各類細(xì)胞的百分比)。2.4.3細(xì)胞三色染色左肺組織經(jīng)甲醛固定24h后,常規(guī)乙醇脫水、石蠟包埋切片,厚度為3μm。行蘇木精-伊紅(HE)染色,Masson三色染色。每只大鼠選取3張肺組織切片,每張切片以單盲法選取橫斷面較圓、直徑100μm的細(xì)支氣管,至少觀察5支。鏡下觀察病理學(xué)改變。2.4.4腸道重塑程度測量值應(yīng)用LeciaQwinV3圖像分析軟件測定氣道壁總面積(Wat)、管壁平滑肌面積(Wam)、支氣管基底膜周徑(Pbm),支氣管周圍膠原纖維面積(Wac)。所有測量值用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化,分別以Wat/PbmWam/Pbm表示,代表相應(yīng)的管壁層厚度,反映氣道重塑的程度。并以校正后的膠原纖維面積(μm2/μm)表示膠原纖維含量。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法單因素方差分析p型化合應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,采用單因素方差分析(one-wayANOVA),多組間兩兩比較采用LSD法,數(shù)據(jù)采用表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1模型組患者呼吸急性毒性的比較正常組:體質(zhì)量逐漸增加,體毛順滑有光澤,灌注生理鹽水后無不適;模型組:抗原致敏激發(fā)后出現(xiàn)行動遲緩、反應(yīng)遲鈍、拱背聚群、體毛失去光澤、呼吸急促、腹肌收縮、活動后呼吸急促加重;全蝎-蜈蚣組:激發(fā)后出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮較模型組輕,毛發(fā)較模型組有光澤。3.2兩組增多,中方懸架細(xì)胞減少,挑戰(zhàn)細(xì)胞多樣性模型組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較正常組增多,吞噬細(xì)胞減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。全蝎-蜈蚣組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較模型組減少,吞噬細(xì)胞增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。3.3全蟹-瞳組正常組:氣道黏膜結(jié)構(gòu)完整,無氣道壁增厚,無明顯炎癥反應(yīng);模型組:氣道壁增厚明顯且結(jié)構(gòu)不完整,氣道基底膜層和平滑肌層明顯增厚,氣道黏膜皺襞增多,氣道黏膜炎細(xì)胞浸潤明顯、以嗜酸粒細(xì)胞為主;全蝎-蜈蚣組:氣道壁增厚不明顯、結(jié)構(gòu)尚完整,氣道基底膜層和平滑肌層輕度增厚,氣道黏膜炎細(xì)胞浸潤輕微。見圖1~2。3.4比較兩組患者的統(tǒng)計學(xué)價值模型組Wat/Pbm,Wam/Pbm,Wac/Pbm與正常組相比均有顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比,全蝎-蜈蚣組Wat/Pbm,Wam/Pbm,Wac/Pbm均有顯著減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。4對感冒病的治療支氣管哮喘是以多種細(xì)胞參與的氣道炎癥反應(yīng)性疾病,氣道重塑是指氣道在慢性炎癥的反復(fù)刺激下發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)性變化,表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤,上皮細(xì)胞增生和化生,上皮下纖維化,腺體增生肥大,細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基底膜增厚、氣道平滑肌增厚及血管生成,是哮喘氣道病理改變的重要病理基礎(chǔ)。目前針對氣道重塑,西醫(yī)應(yīng)用類固醇激素吸入療法抗炎治療,雖可部分抑制氣道重建,但能否有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)氣道基底膜的增厚還存在意見分歧。因此,尋找有效控制氣道炎癥、抑制氣道重塑的藥物是目前哮喘治療中的當(dāng)務(wù)之急。支氣管哮喘屬于祖國醫(yī)學(xué)“哮病”范疇,自仲景以下,各家論及哮喘多認(rèn)為發(fā)病夙根為“痰”,其反復(fù)發(fā)作、時發(fā)時止、遷延難愈的特點與風(fēng)性善行而數(shù)變的特征相符,風(fēng)痰搏結(jié),上壅肺氣,痰阻氣閉,“風(fēng)勝則痙”,致使氣道攣急、氣機升降受阻,喘鳴有聲發(fā)為哮喘;同時,哮喘反復(fù)發(fā)作,病勢遷延,久咳入絡(luò)生瘀,病久耗傷肺氣,氣虛心脈不暢、瘀血內(nèi)結(jié),痰濁與瘀血膠結(jié)不解、肺氣不利,發(fā)為哮喘,故臨床表現(xiàn)除咳嗽喘息、喉間痰鳴以外,還多見唇甲青紫,面色黎黑,肌膚甲錯,舌質(zhì)暗紅或紫暗,或有瘀斑,脈澀等痰瘀互結(jié)之癥;可見,“風(fēng)痰”、“血瘀”在哮喘的發(fā)病中均占有重要位置。因此,哮喘治療中需重視祛風(fēng)化痰逐瘀藥物的應(yīng)用。針對哮喘“風(fēng)痰”“血瘀”病理基礎(chǔ),病勢多反復(fù)遷延,久病邪氣深入經(jīng)隧,經(jīng)絡(luò)閉塞不通,已成沉疴之疾。欲使沉疴得起,非草木之品所能宣達,必借蟲蟻之類入絡(luò)搜剔竄透。正如葉天士所言“久則邪風(fēng)混處其間,草木不能見其效,當(dāng)以蟲蟻疏絡(luò)逐邪”。上海市名老中醫(yī)吳銀根教授對于反復(fù)發(fā)作的頑固性哮喘重癥病例,常使用全蝎、蜈蚣以搜風(fēng)通絡(luò)、消散肺內(nèi)伏痰頑瘀,以達解痙平喘之效。在哮喘的臨證實踐中,參合歷代各家治驗,立足于“風(fēng)痰血瘀”之本,宣肺平喘兼顧祛風(fēng)逐瘀,加用蟲類藥物,取其“飛者升,走者降,靈動迅速,追拔沉混氣血之邪”的特性,其中以“全蝎-蜈蚣”這一經(jīng)驗藥對聯(lián)用居多,走竄入絡(luò)、搜剔逐邪,針對難治性哮喘每獲良效。本研究在成功制備哮喘模型的基礎(chǔ)上,通過BALF細(xì)胞計數(shù)及分類、病理學(xué)觀察、組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定,對“全蝎-蜈蚣”對哮喘氣道炎癥、氣道重塑的干預(yù)作用進行了研究。研究發(fā)現(xiàn):模型組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞比例增加,符合哮喘炎癥反應(yīng)性疾病的特征,氣道壁、基底膜、平滑肌層均明顯增厚,膠原纖維增生明顯,符合氣道重塑的病理學(xué)改變。而全蝎-蜈蚣組可顯著減少BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞比例,減緩氣道壁、平滑肌層增厚的趨勢,減輕膠原纖維增生,提示運用“全蝎-蜈蚣”對哮喘氣道炎癥、氣道重塑具有一定的抑制作用。綜上所述,祖國醫(yī)學(xué)對蟲類藥的認(rèn)識源遠(yuǎn)流長,因其“蠕動、飛靈走竄”之性廣泛應(yīng)用于臨床,其中“全蝎-蜈蚣”這一藥對在痹證、瘡瘍腫毒及腫瘤的治療研究中較為深入,而對治療哮喘的研究則多停留在專家治驗總結(jié)、臨床癥狀觀察等方面,對哮喘干預(yù)機制的實驗研究剛剛起步、少見報道。本次實驗初步證明“全蝎-蜈蚣”可改善哮喘模型大鼠氣道炎癥,同時對氣道重塑有一定的改善或延緩作用,但“全蝎-蜈蚣”干預(yù)氣道重塑的具體作用機制,尚有待進一步深入研究。將SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、全蝎-蜈蚣組,每組10只。參見文獻方法復(fù)制哮喘動物模型,模型組、全蝎-蜈蚣組于實驗第0,7天,以新鮮配制的致敏液(1g·L-1OVA,溶于1%氫氧化鋁溶液內(nèi))1mL腹腔注射致敏。第15天開始,將大鼠置于自制霧化箱(40cm×30cm×20cm)內(nèi),以超聲霧化器霧化,吸入