竹類植物分子育種研究進展

竹類植物分子育種研究進展

竹子是地球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。它生長迅速，用途廣泛。不僅具有重要的經(jīng)濟價值,而且具有良好的水源涵養(yǎng)和水土保持功能。竹林是經(jīng)濟效益和生態(tài)效益良好結合于一體的林種,利用價值和生態(tài)價值極高,比同面積的森林多放氧35%,被公認為21世紀世界上最重要的植物資源之一。有人認為“沒有竹子,陸地將沒有生命”。此外,竹子具有似草非草、似樹非樹的特性,并且它是森林資源的重要組成部分,能產(chǎn)生的巨大經(jīng)濟效益,因此竹類植物研究愈來愈受到重視。目前在竹子分類、生長、繁殖、形態(tài)結構、竹材理化性質和加工利用等方面的研究已取得很多成果并得到推廣;竹子遺傳改良研究也取得了一定進展。然而,竹類植物的分子生物學研究目前嚴重滯后于禾本科的農(nóng)作物如水稻[12～21],本文中,簡要綜述了竹類植物的分子生物學研究現(xiàn)狀,并提出竹類植物研究的重點和發(fā)展方向。1竹類植物總rna提取和分子標記酶植物DNA和RNA的提取是進行植物分子生物學研究的第一步,對后續(xù)試驗工作的開展尤為重要。由于竹類植物的糖類和酚類含量高,一般很難提取到適合研究用的RNA或DNA,所以許多研究者致力于提取方法的改進研究,并將此部分經(jīng)驗總結成文,這些有效的和提取方法為進一步開展竹類植物分子生物學研究提供了良好的基礎,如提取的DNA可用于分子標記、基因分離提取的RNA可用于RT-PCR、Northern雜交、cDNA文庫的構建等研究。周明兵、湯定欽提出一種適用于小佛肚竹Bambusaventricosa和螺節(jié)竹Pleioblastusgramineus等竹類植物總RNA提取方法,該方法操作簡便、無DNA污染,且產(chǎn)率高。普曉蘭等用改良CTAB法從巨龍竹硅膠干燥的葉片中提取基因組DNA,并成功進行RAPD擴增。2竹子育種研究分子標記從20世紀80年代開始應用于竹子研究,主要進行群體間和群體內DNA(包括核基因組DNA和葉綠體DNA)水平上遺傳變異的研究,以闡明竹種群體分化的遺傳學和生態(tài)基礎。利用分子標記技術研究竹子遺傳分化是竹子育種的一個熱點,通過研究初步闡明了竹子的遺傳變異,為竹種的育種和分類提供了理論依據(jù)。同時用于不同竹種間的分類學研究,以彌補傳統(tǒng)分類方法的不足,進一步明確了竹種的系統(tǒng)分類地位。這些研究主要采用RFLP、RAPD和AFLP等分子生物學方法。2.1剛竹屬竹種的遺傳多樣性RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。Friar等利用RFLP技術對剛竹屬竹種的遺傳變異、分類學及系統(tǒng)進化進行了研究,通過計算遺傳距離檢測種內和種間遺傳變異的程度,并對37種竹種的基因組DNA用EcoRV,HindⅢ消化和10種探針進行分析及后來用3種不同限制性內切酶對20種Phyllostachys的DNA進行消化,發(fā)現(xiàn)每一種酶、探針組合都呈現(xiàn)多樣性,這是首次應用DNA多樣性對竹子進行研究。Kobayashi等借助RFLP技術研究了竹子葉綠體DNA的多態(tài)性,Watanabe等用15種限制性內切酶對亞洲包括熱帶屬和溫帶屬的16個竹種葉綠體DNA的分析進行了分析,認為葉綠體DNA多樣性對系統(tǒng)發(fā)育研究是有價值的。2.2苦竹與表土、超基化竹的rapd基因測序和聚類研究RAPD(RandomAmplificationPolymorphicDNA,隨機擴增多態(tài)性DNA)簡單、實用,主要用于基因組的鑒定、特征標記和作圖,近20年來國內外一些研究者對竹子開展了大量的RAPD研究工作,為今后早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆竹子遺傳性狀改良提供了分子鑒定基礎。吳益民等利用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術對考順竹、鳳尾竹、綠竹和白綠竹4個品種,用20種引物進行PCR擴增,其中有17種可擴增出DNA條帶,構成RAPD指紋圖譜,4種竹子兩兩之間的相似系數(shù)在36%～73%之間。楊光耀、趙奇僧利用RAPD技術分析了苦竹類植物,采用20個引物用于種間遺傳相似性分析,結果表明苦竹與宜興苦竹關系密切;大明竹與其它4種關系較遠;形態(tài)上將中國產(chǎn)、日本產(chǎn)苦竹分成2類,但沒有得到RAPD分析的支持。龐延軍等采用RAPD的實驗方法,研究了腫節(jié)少穗竹Oligostachyumoedogonatum與4個近緣竹種的關系:在DNA水平上腫節(jié)少穗竹與酸竹屬Acidosasa的其它物種存在明顯差異等。師麗華、楊光耀利用RAPD標記技術將7個毛竹的變型或栽培型同屬的2個近緣種明顯區(qū)別開來。廖國華報道了由37個隨機引物擴增出的毛竹黃、白筍個體RAPD指紋圖譜,從分子水平上證實了毛竹黃、白筍個體存在真實的遺傳差異。方偉等對雷竹的19個栽培類型及2個近緣種進行了RAPD分析,聚類結果可將雷竹的不同栽培類型及其近緣種區(qū)分開來,以前認為是雷竹一栽培型的永嘉雷竹不屬于Ph.praecox種系。普曉蘭等對巨龍竹Dendrocalamussinicus種下具有2個明顯不同的變異類型“通直型”和“歪腳型”進行了RAPD分析,結果表明歪腳類型的遺傳多樣性高于通直類型,巨龍竹變異類型群體之間及群體之內均出現(xiàn)顯著的分化。另外,Hsiao等利用RAPD技術分析了臺灣玉山竹Yushanianiitakayamensis(Hayata)Kengf.5個樣品的群體遺傳結構并對無性系進行了鑒定。邢新婷、傅懋毅以麻竹DNA為模板,對影響麻竹RAPD擴增的重要參數(shù)進行優(yōu)化試驗,建立了RAPD反應的最適體系;同時邢新婷、傅懋毅采用隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)方法對6個群體30叢撐篙竹個體進行了遺傳變異的研究,28個隨機引物共檢測到173個位點,其中85個是多態(tài)位點。同時用UPGMA方法將不同產(chǎn)地的撐篙竹6個群體聚為3類。Das等結合RAPD方法并進行克隆和測序,發(fā)展了SCARs(Species-specificMarker)標記法來鑒定Bambusabalcooa和B.tulda2種竹子,這是SCARs標記法應用于竹子研究的首篇報道?？傊?RAPD和SCARs等分子標記方法在過去的20多年中已成為研究竹子分子分類的有力工具,在分子水平上探討竹類植物的遺傳變異發(fā)揮了應有的作用2.3不同種類竹子的遺傳穩(wěn)定性研究AFLP(AmplicationFragmentLengthPolymorphism,擴增性片段長度多態(tài)性)。就DNA多態(tài)性而言,AFLP的靈敏性要優(yōu)于RFLP、RAPD等分子標記技術。AFLP分子標記主要應用于鑒定剛竹屬Phyllostachys、竹屬Bambusa和箭竹屬Fargesia的種和品種間的差異,以及品種保護。Loh等運用AFLP技術對竹子的遺傳變異和種的相互關系作了有益的嘗試。他們利用8個引物組合對15個竹種進行AFLP分析,根據(jù)AFLP產(chǎn)生的特異性條帶成功區(qū)分了不同的竹種、鑒別了特殊竹種的基因型。Suyama等使用3對選擇性引物對日本矮竹Sasasenanensis的51個葉片樣本進行AFLP研究,每個樣本檢測到135～166條指紋,在24～83條不同的片斷中有22條片斷可用作指紋,鑒定出22個無性系等。Isagi等通過AFLP技術研究了剛竹屬竹子Phyllostachyspubescens(Mazel)Ohwi的無性結構和開花特點,分析表明不同的遺傳起源具有不同的開花時間。2.4利用現(xiàn)代生物學技術進行研究ZhaoX.,KochertG.將水稻微衛(wèi)星(GGC)n應用到竹子遺傳圖譜研究上,李淑嫻等將水稻微衛(wèi)星引物應用到竹子分子系統(tǒng)的研究上,結果表明與傳統(tǒng)的分類結果不同,巴山木竹屬作為1個單獨的屬是成立的,并從不同的層面對青籬竹屬相關屬及屬下一些竹種的關系提供了新的研究結果,為利用現(xiàn)代分子生物學技術對廣義青籬竹屬的系統(tǒng)學研究提供了借鑒。利用特定引物的PCR也被用于竹子的VNTR研究中,其中利用微衛(wèi)星(GGC)n作為擴增引物,這些引物在Arundinariaamabilis、Phyllostachysrubromarginata和一種未確認的Bambusa等3竹種的基因組相同區(qū)域上能進行擴增,證明VNTR是竹子中非常靈敏的分子標記。這些工作對開展竹子的分子生物學研究提供了新的思路和方法。3生物技術的遺傳改良和遺傳改良3.1竹子組培中愈傷組織誘導建立的技術體系竹子組培是竹子育種的一個重要途徑。研究人員對20余屬70多個竹種開展了組織培養(yǎng)研究,闡明了外植體、基因型、激素種類、濃度和不同培養(yǎng)基成分對竹子組培中愈傷組織誘導形成、植株再生以及誘導生根效率的影響,并建立了成熟的組織培養(yǎng)技術體系,為竹子育種工作奠定了基礎[48～50]。如前所述,遺傳育種分子標記作為一種新型的遺傳標記和重要的育種工具,在竹子品種鑒定、分類、分子遺傳學基礎、遺傳變異等方面得到了不同程度的應用。3.2叢生竹類基因突變育種卓仁英、劉曉光等對影響麻竹轉基因過程中的幾個關鍵性因素進行了研究,其中卡那霉素和潮霉素都可以用于麻竹抗性愈傷組織篩選,初步建立了麻竹轉基因技術體系,為叢生竹類轉基因育種奠定了基礎。俄羅斯形態(tài)遺傳學研究所的專家利用轉基因技術,培育出橫截面為方形的竹子。用這種竹子砌筑的墻壁能像空心磚墻壁一樣,提高房屋的保溫隔熱性能?？蒲腥藛T從蠟菊的細胞中分離出塑造蠟菊稈形的基因,將其轉入擬南芥細胞中。經(jīng)過實驗改進,研究者培育出方稈擬南芥。此后,將方稈擬南芥的稈形塑造基因和傘形科植物——大型白芷的光合作用基因導入竹子細胞中,并最終在伏爾加河下游地區(qū)培植出方稈竹子。4基因分離和鑒定4.1dimads18竹子開花是一個很復雜的過程。Isagi等研究了開花特點與無性系的關系。田波等從竹類植物麻竹Dendrocalamuslatiflorus幼穗中克隆到一個含完整編碼區(qū)及3位端非翻譯區(qū)的cDNA,命名為DIMADS18。該cDNA全長1039bp,編碼區(qū)共編碼249個氨基酸,具有典型的植物MADS盒基因結構。序列相似性分析結果表明,DIMADS18屬于AGL6亞家族,其氨基酸序列與水稻Oryzasatival的MADS盒基因osMADS6同源性最高,序列一致性為88%,與擬南芥Arabidopsisthaliana的AGL6一致性為59%。DIMADS18在擬南芥中異位表達,轉基因擬南芥表現(xiàn)出葉卷曲、植株矮小、開花時間提前、花聚生于花序頂端等性狀,表明DIMADS18很可能參與麻竹開花時間的調控。他們采用RACE方法從麻竹中分離到16個MADS-box基因cDNA全長,在EMBL庫中的登錄號為:599750～599765。4.2生物酶基因檢測Matsui研究了谷氨酸合成酶(glutaminsynthetase)活性變化與Moso竹筍基因表達情況,并研究了儲藏期pBA-PAL酶的活性變化和Moso竹筍pBA-PAL、竹子PAL基因分子克隆和基因表達情況。他們還研究了BA-ACS、ACC合成酶和BA-ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylateoxidase)基因。竹類植物在EMBL或NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄核酸序列有毛竹PhyllostachysedulisACCOxidase,rbcL(Chloroplastribulosebisphosphate)基因;毛竹的完整的BA-ACOmRNA全序列1375堿基,BA-ACS的ACC的cDNA全序列及BA-AC、pBA-PAL和pBA-GS部分mRNA序列。1個綠竹BambusaoldhamiiBoSUS1部分mRNA序列和3個BoSUS1蔗糖mRNA全序列合成酶的mRNA全序列。還有酸竹屬Acidosasa、青籬竹屬Arundinaria、流蘇香竹Chimonocalamusfimbriatus等竹種的顆粒結合型淀粉合成酶granule-boundstarchsynthase,GBSSGBBS基因,即Waxy基因的部分序列.竹屬Bambusa磷酸-蔗糖合成酶基因、PAL1基因幾丁質酶的mRNA的cDNA全序列。矢竹Pseudosasajaponica、毛竹、崗姬竹Shibataeakumasaca5.8SrRNA基因的cDNA全序列。因篇幅關系其余基因未列出。5糖體dna內轉錄間隔區(qū)研究在植物系統(tǒng)發(fā)育研究過程中,通常采用的基因位點主要有葉綠體基因組的16SrRNA,23SrRNA,psbA,rbcL,rpoC2及matK基因等,同時葉綠體基因組的內含子(Intron)區(qū)和基因間隔區(qū)(Intergenicspacers,IGS)比編碼區(qū)存在更多的變異和利用核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacers,ITS)序列進行植物系統(tǒng)發(fā)育研究也有較廣泛的應用。Zhang等禾本科rpl16內含子序列中作用。Clark等對草本植物、竹子與禾本科的幾種植物進行比較,發(fā)現(xiàn)了2個重要的竹種群:溫帶和熱帶竹種群,且熱帶竹種群又進一步被分成古代竹種和近代熱帶竹種。諸葛強等研究了籬竹屬核糖體DNAITS序列及親緣關系研究:利用PCR擴增產(chǎn)物直接測序的方法分析廣義青籬竹屬中有關爭議類群的代表種或模式種(毛竹為外類群)等18種竹種的核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)ITS序列。茶稈竹與仙居苦竹關系非常密切,茶稈竹可歸隸到青籬竹屬中;翠竹和菲白竹關系密切,且與苦竹類竹種分為兩個分支。Guo從GBSSI基因和ITS核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)序列研究了筱竹屬類群,利用ITS核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)序列研究了禾本科、竹亞科及