竹類(lèi)植物分子育種研究進(jìn)展

竹類(lèi)植物分子育種研究進(jìn)展

竹子是地球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。它生長(zhǎng)迅速，用途廣泛。不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,而且具有良好的水源涵養(yǎng)和水土保持功能。竹林是經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益良好結(jié)合于一體的林種,利用價(jià)值和生態(tài)價(jià)值極高,比同面積的森林多放氧35%,被公認(rèn)為21世紀(jì)世界上最重要的植物資源之一。有人認(rèn)為“沒(méi)有竹子,陸地將沒(méi)有生命”。此外,竹子具有似草非草、似樹(shù)非樹(shù)的特性,并且它是森林資源的重要組成部分,能產(chǎn)生的巨大經(jīng)濟(jì)效益,因此竹類(lèi)植物研究愈來(lái)愈受到重視。目前在竹子分類(lèi)、生長(zhǎng)、繁殖、形態(tài)結(jié)構(gòu)、竹材理化性質(zhì)和加工利用等方面的研究已取得很多成果并得到推廣;竹子遺傳改良研究也取得了一定進(jìn)展。然而,竹類(lèi)植物的分子生物學(xué)研究目前嚴(yán)重滯后于禾本科的農(nóng)作物如水稻[12～21],本文中,簡(jiǎn)要綜述了竹類(lèi)植物的分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀,并提出竹類(lèi)植物研究的重點(diǎn)和發(fā)展方向。1竹類(lèi)植物總rna提取和分子標(biāo)記酶植物DNA和RNA的提取是進(jìn)行植物分子生物學(xué)研究的第一步,對(duì)后續(xù)試驗(yàn)工作的開(kāi)展尤為重要。由于竹類(lèi)植物的糖類(lèi)和酚類(lèi)含量高,一般很難提取到適合研究用的RNA或DNA,所以許多研究者致力于提取方法的改進(jìn)研究,并將此部分經(jīng)驗(yàn)總結(jié)成文,這些有效的和提取方法為進(jìn)一步開(kāi)展竹類(lèi)植物分子生物學(xué)研究提供了良好的基礎(chǔ),如提取的DNA可用于分子標(biāo)記、基因分離提取的RNA可用于RT-PCR、Northern雜交、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建等研究。周明兵、湯定欽提出一種適用于小佛肚竹Bambusaventricosa和螺節(jié)竹Pleioblastusgramineus等竹類(lèi)植物總RNA提取方法,該方法操作簡(jiǎn)便、無(wú)DNA污染,且產(chǎn)率高。普曉蘭等用改良CTAB法從巨龍竹硅膠干燥的葉片中提取基因組DNA,并成功進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。2竹子育種研究分子標(biāo)記從20世紀(jì)80年代開(kāi)始應(yīng)用于竹子研究,主要進(jìn)行群體間和群體內(nèi)DNA(包括核基因組DNA和葉綠體DNA)水平上遺傳變異的研究,以闡明竹種群體分化的遺傳學(xué)和生態(tài)基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究竹子遺傳分化是竹子育種的一個(gè)熱點(diǎn),通過(guò)研究初步闡明了竹子的遺傳變異,為竹種的育種和分類(lèi)提供了理論依據(jù)。同時(shí)用于不同竹種間的分類(lèi)學(xué)研究,以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類(lèi)方法的不足,進(jìn)一步明確了竹種的系統(tǒng)分類(lèi)地位。這些研究主要采用RFLP、RAPD和AFLP等分子生物學(xué)方法。2.1剛竹屬竹種的遺傳多樣性RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類(lèi)的研究。Friar等利用RFLP技術(shù)對(duì)剛竹屬竹種的遺傳變異、分類(lèi)學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究,通過(guò)計(jì)算遺傳距離檢測(cè)種內(nèi)和種間遺傳變異的程度,并對(duì)37種竹種的基因組DNA用EcoRV,HindⅢ消化和10種探針進(jìn)行分析及后來(lái)用3種不同限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)20種Phyllostachys的DNA進(jìn)行消化,發(fā)現(xiàn)每一種酶、探針組合都呈現(xiàn)多樣性,這是首次應(yīng)用DNA多樣性對(duì)竹子進(jìn)行研究。Kobayashi等借助RFLP技術(shù)研究了竹子葉綠體DNA的多態(tài)性,Watanabe等用15種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)亞洲包括熱帶屬和溫帶屬的16個(gè)竹種葉綠體DNA的分析進(jìn)行了分析,認(rèn)為葉綠體DNA多樣性對(duì)系統(tǒng)發(fā)育研究是有價(jià)值的。2.2苦竹與表土、超基化竹的rapd基因測(cè)序和聚類(lèi)研究RAPD(RandomAmplificationPolymorphicDNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)簡(jiǎn)單、實(shí)用,主要用于基因組的鑒定、特征標(biāo)記和作圖,近20年來(lái)國(guó)內(nèi)外一些研究者對(duì)竹子開(kāi)展了大量的RAPD研究工作,為今后早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆竹子遺傳性狀改良提供了分子鑒定基礎(chǔ)。吳益民等利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對(duì)考順竹、鳳尾竹、綠竹和白綠竹4個(gè)品種,用20種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中有17種可擴(kuò)增出DNA條帶,構(gòu)成RAPD指紋圖譜,4種竹子兩兩之間的相似系數(shù)在36%～73%之間。楊光耀、趙奇僧利用RAPD技術(shù)分析了苦竹類(lèi)植物,采用20個(gè)引物用于種間遺傳相似性分析,結(jié)果表明苦竹與宜興苦竹關(guān)系密切;大明竹與其它4種關(guān)系較遠(yuǎn);形態(tài)上將中國(guó)產(chǎn)、日本產(chǎn)苦竹分成2類(lèi),但沒(méi)有得到RAPD分析的支持。龐延軍等采用RAPD的實(shí)驗(yàn)方法,研究了腫節(jié)少穗竹Oligostachyumoedogonatum與4個(gè)近緣竹種的關(guān)系:在DNA水平上腫節(jié)少穗竹與酸竹屬Acidosasa的其它物種存在明顯差異等。師麗華、楊光耀利用RAPD標(biāo)記技術(shù)將7個(gè)毛竹的變型或栽培型同屬的2個(gè)近緣種明顯區(qū)別開(kāi)來(lái)。廖國(guó)華報(bào)道了由37個(gè)隨機(jī)引物擴(kuò)增出的毛竹黃、白筍個(gè)體RAPD指紋圖譜,從分子水平上證實(shí)了毛竹黃、白筍個(gè)體存在真實(shí)的遺傳差異。方偉等對(duì)雷竹的19個(gè)栽培類(lèi)型及2個(gè)近緣種進(jìn)行了RAPD分析,聚類(lèi)結(jié)果可將雷竹的不同栽培類(lèi)型及其近緣種區(qū)分開(kāi)來(lái),以前認(rèn)為是雷竹一栽培型的永嘉雷竹不屬于Ph.praecox種系。普曉蘭等對(duì)巨龍竹Dendrocalamussinicus種下具有2個(gè)明顯不同的變異類(lèi)型“通直型”和“歪腳型”進(jìn)行了RAPD分析,結(jié)果表明歪腳類(lèi)型的遺傳多樣性高于通直類(lèi)型,巨龍竹變異類(lèi)型群體之間及群體之內(nèi)均出現(xiàn)顯著的分化。另外,Hsiao等利用RAPD技術(shù)分析了臺(tái)灣玉山竹Yushanianiitakayamensis(Hayata)Kengf.5個(gè)樣品的群體遺傳結(jié)構(gòu)并對(duì)無(wú)性系進(jìn)行了鑒定。邢新婷、傅懋毅以麻竹DNA為模板,對(duì)影響麻竹RAPD擴(kuò)增的重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),建立了RAPD反應(yīng)的最適體系;同時(shí)邢新婷、傅懋毅采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)方法對(duì)6個(gè)群體30叢撐篙竹個(gè)體進(jìn)行了遺傳變異的研究,28個(gè)隨機(jī)引物共檢測(cè)到173個(gè)位點(diǎn),其中85個(gè)是多態(tài)位點(diǎn)。同時(shí)用UPGMA方法將不同產(chǎn)地的撐篙竹6個(gè)群體聚為3類(lèi)。Das等結(jié)合RAPD方法并進(jìn)行克隆和測(cè)序,發(fā)展了SCARs(Species-specificMarker)標(biāo)記法來(lái)鑒定Bambusabalcooa和B.tulda2種竹子,這是SCARs標(biāo)記法應(yīng)用于竹子研究的首篇報(bào)道。總之,RAPD和SCARs等分子標(biāo)記方法在過(guò)去的20多年中已成為研究竹子分子分類(lèi)的有力工具,在分子水平上探討竹類(lèi)植物的遺傳變異發(fā)揮了應(yīng)有的作用2.3不同種類(lèi)竹子的遺傳穩(wěn)定性研究AFLP(AmplicationFragmentLengthPolymorphism,擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)。就DNA多態(tài)性而言,AFLP的靈敏性要優(yōu)于RFLP、RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP分子標(biāo)記主要應(yīng)用于鑒定剛竹屬Phyllostachys、竹屬Bambusa和箭竹屬Fargesia的種和品種間的差異,以及品種保護(hù)。Loh等運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)竹子的遺傳變異和種的相互關(guān)系作了有益的嘗試。他們利用8個(gè)引物組合對(duì)15個(gè)竹種進(jìn)行AFLP分析,根據(jù)AFLP產(chǎn)生的特異性條帶成功區(qū)分了不同的竹種、鑒別了特殊竹種的基因型。Suyama等使用3對(duì)選擇性引物對(duì)日本矮竹Sasasenanensis的51個(gè)葉片樣本進(jìn)行AFLP研究,每個(gè)樣本檢測(cè)到135～166條指紋,在24～83條不同的片斷中有22條片斷可用作指紋,鑒定出22個(gè)無(wú)性系等。Isagi等通過(guò)AFLP技術(shù)研究了剛竹屬竹子Phyllostachyspubescens(Mazel)Ohwi的無(wú)性結(jié)構(gòu)和開(kāi)花特點(diǎn),分析表明不同的遺傳起源具有不同的開(kāi)花時(shí)間。2.4利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究ZhaoX.,KochertG.將水稻微衛(wèi)星(GGC)n應(yīng)用到竹子遺傳圖譜研究上,李淑嫻等將水稻微衛(wèi)星引物應(yīng)用到竹子分子系統(tǒng)的研究上,結(jié)果表明與傳統(tǒng)的分類(lèi)結(jié)果不同,巴山木竹屬作為1個(gè)單獨(dú)的屬是成立的,并從不同的層面對(duì)青籬竹屬相關(guān)屬及屬下一些竹種的關(guān)系提供了新的研究結(jié)果,為利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)廣義青籬竹屬的系統(tǒng)學(xué)研究提供了借鑒。利用特定引物的PCR也被用于竹子的VNTR研究中,其中利用微衛(wèi)星(GGC)n作為擴(kuò)增引物,這些引物在A(yíng)rundinariaamabilis、Phyllostachysrubromarginata和一種未確認(rèn)的Bambusa等3竹種的基因組相同區(qū)域上能進(jìn)行擴(kuò)增,證明VNTR是竹子中非常靈敏的分子標(biāo)記。這些工作對(duì)開(kāi)展竹子的分子生物學(xué)研究提供了新的思路和方法。3生物技術(shù)的遺傳改良和遺傳改良3.1竹子組培中愈傷組織誘導(dǎo)建立的技術(shù)體系竹子組培是竹子育種的一個(gè)重要途徑。研究人員對(duì)20余屬70多個(gè)竹種開(kāi)展了組織培養(yǎng)研究,闡明了外植體、基因型、激素種類(lèi)、濃度和不同培養(yǎng)基成分對(duì)竹子組培中愈傷組織誘導(dǎo)形成、植株再生以及誘導(dǎo)生根效率的影響,并建立了成熟的組織培養(yǎng)技術(shù)體系,為竹子育種工作奠定了基礎(chǔ)[48～50]。如前所述,遺傳育種分子標(biāo)記作為一種新型的遺傳標(biāo)記和重要的育種工具,在竹子品種鑒定、分類(lèi)、分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)、遺傳變異等方面得到了不同程度的應(yīng)用。3.2叢生竹類(lèi)基因突變育種卓仁英、劉曉光等對(duì)影響麻竹轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵性因素進(jìn)行了研究,其中卡那霉素和潮霉素都可以用于麻竹抗性愈傷組織篩選,初步建立了麻竹轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,為叢生竹類(lèi)轉(zhuǎn)基因育種奠定了基礎(chǔ)。俄羅斯形態(tài)遺傳學(xué)研究所的專(zhuān)家利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),培育出橫截面為方形的竹子。用這種竹子砌筑的墻壁能像空心磚墻壁一樣,提高房屋的保溫隔熱性能?？蒲腥藛T從蠟菊的細(xì)胞中分離出塑造蠟菊稈形的基因,將其轉(zhuǎn)入擬南芥細(xì)胞中。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)改進(jìn),研究者培育出方稈擬南芥。此后,將方稈擬南芥的稈形塑造基因和傘形科植物——大型白芷的光合作用基因?qū)胫褡蛹?xì)胞中,并最終在伏爾加河下游地區(qū)培植出方稈竹子。4基因分離和鑒定4.1dimads18竹子開(kāi)花是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程。Isagi等研究了開(kāi)花特點(diǎn)與無(wú)性系的關(guān)系。田波等從竹類(lèi)植物麻竹Dendrocalamuslatiflorus幼穗中克隆到一個(gè)含完整編碼區(qū)及3位端非翻譯區(qū)的cDNA,命名為DIMADS18。該cDNA全長(zhǎng)1039bp,編碼區(qū)共編碼249個(gè)氨基酸,具有典型的植物MADS盒基因結(jié)構(gòu)。序列相似性分析結(jié)果表明,DIMADS18屬于A(yíng)GL6亞家族,其氨基酸序列與水稻Oryzasatival的MADS盒基因osMADS6同源性最高,序列一致性為88%,與擬南芥Arabidopsisthaliana的AGL6一致性為59%。DIMADS18在擬南芥中異位表達(dá),轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出葉卷曲、植株矮小、開(kāi)花時(shí)間提前、花聚生于花序頂端等性狀,表明DIMADS18很可能參與麻竹開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控。他們采用RACE方法從麻竹中分離到16個(gè)MADS-box基因cDNA全長(zhǎng),在EMBL庫(kù)中的登錄號(hào)為:599750～599765。4.2生物酶基因檢測(cè)Matsui研究了谷氨酸合成酶(glutaminsynthetase)活性變化與Moso竹筍基因表達(dá)情況,并研究了儲(chǔ)藏期pBA-PAL酶的活性變化和Moso竹筍pBA-PAL、竹子PAL基因分子克隆和基因表達(dá)情況。他們還研究了BA-ACS、ACC合成酶和BA-ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylateoxidase)基因。竹類(lèi)植物在EMBL或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄核酸序列有毛竹PhyllostachysedulisACCOxidase,rbcL(Chloroplastribulosebisphosphate)基因;毛竹的完整的BA-ACOmRNA全序列1375堿基,BA-ACS的ACC的cDNA全序列及BA-AC、pBA-PAL和pBA-GS部分mRNA序列。1個(gè)綠竹BambusaoldhamiiBoSUS1部分mRNA序列和3個(gè)BoSUS1蔗糖mRNA全序列合成酶的mRNA全序列。還有酸竹屬Acidosasa、青籬竹屬Arundinaria、流蘇香竹Chimonocalamusfimbriatus等竹種的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶granule-boundstarchsynthase,GBSSGBBS基因,即Waxy基因的部分序列.竹屬Bambusa磷酸-蔗糖合成酶基因、PAL1基因幾丁質(zhì)酶的mRNA的cDNA全序列。矢竹Pseudosasajaponica、毛竹、崗姬竹Shibataeakumasaca5.8SrRNA基因的cDNA全序列。因篇幅關(guān)系其余基因未列出。5糖體dna內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)研究在植物系統(tǒng)發(fā)育研究過(guò)程中,通常采用的基因位點(diǎn)主要有葉綠體基因組的16SrRNA,23SrRNA,psbA,rbcL,rpoC2及matK基因等,同時(shí)葉綠體基因組的內(nèi)含子(Intron)區(qū)和基因間隔區(qū)(Intergenicspacers,IGS)比編碼區(qū)存在更多的變異和利用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacers,ITS)序列進(jìn)行植物系統(tǒng)發(fā)育研究也有較廣泛的應(yīng)用。Zhang等禾本科rpl16內(nèi)含子序列中作用。Clark等對(duì)草本植物、竹子與禾本科的幾種植物進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)了2個(gè)重要的竹種群:溫帶和熱帶竹種群,且熱帶竹種群又進(jìn)一步被分成古代竹種和近代熱帶竹種。諸葛強(qiáng)等研究了籬竹屬核糖體DNAITS序列及親緣關(guān)系研究:利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序的方法分析廣義青籬竹屬中有關(guān)爭(zhēng)議類(lèi)群的代表種或模式種(毛竹為外類(lèi)群)等18種竹種的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列。茶稈竹與仙居苦竹關(guān)系非常密切,茶稈竹可歸隸到青籬竹屬中;翠竹和菲白竹關(guān)系密切,且與苦竹類(lèi)竹種分為兩個(gè)分支。Guo從GBSSI基因和ITS核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列研究了筱竹屬類(lèi)群,利用ITS核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列研究了禾本科、竹亞科及