雞傳染性法氏囊炎活疫苗的制備

雞傳染性法氏囊炎活疫苗的制備

根據(jù)《中華人民共和國動(dòng)物飼料制備和測(cè)試條例》（2000年版），雞澤興綜合征（b87）的活血苗由雞采集、試驗(yàn)和測(cè)試，并通過雞飼配方連接各種有毒藥物。在規(guī)定時(shí)間內(nèi)死亡的胎兒和病雞囊膜的毛尿囊膜中接種疫苗。規(guī)程中接種方法有兩種:一是雞胚絨毛尿囊膜(需做人工氣室)接種法,另一種是雞胚尿囊腔接種法。生產(chǎn)實(shí)踐表明,這兩種方法都有它的不足之處:雞胚絨毛尿囊膜接種法需要做人工氣室,其工藝煩瑣不易掌握,不適合大批量生產(chǎn),而且由于做人工氣室造成的早死棄胚多(物理性死亡),使成本提高,故大多數(shù)生產(chǎn)廠家只有測(cè)毒時(shí)才會(huì)采用,大批量生產(chǎn)已不再使用該方法,而采用雞胚尿囊腔接種法;盡管尿囊腔接種方法易于操作,但在接種雞胚后總會(huì)有一定比例的存活胚(約10%),即或是采用SPF雞胚也是如此,由于活胚胎兒病毒含量比死胚胎兒的病毒含量低得多,一般棄掉不用,這樣也會(huì)使雞胚的利用率降低。為此,我們借鑒雞痘活疫苗生產(chǎn)中曾使用過的雞胚絨毛尿囊膜滲透法來接種雞胚,結(jié)果接種后24h雞胚早死率略高于尿囊腔接種法,但卻大大低于人工氣室絨毛尿囊膜接種法,而且沒有存活雞胚,提高了雞胚利用率,如此彌補(bǔ)了人工氣室絨毛尿囊膜接種法和尿囊腔接種法兩者的不足。1材料和方法1.1材料表面1.1.1雞胚絨尿囊膜接種成生產(chǎn)種毒雞傳染性法氏囊B87株凍干種毒,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供,經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種,收獲感染雞胚的胎兒和絨毛尿囊膜制備成生產(chǎn)種毒。其病毒含量(ELD50/0.2mL)達(dá)107.5以上。1.1.2f雞SPF雞胚由山東濟(jì)南賽斯(SAIS)家禽科技有限公司提供SPF種蛋,自行孵化至10～11日齡的雞胚。1.1.3生理鹽水和冷凍保護(hù)劑0.85%生理鹽水和含5%蔗糖及含10%脫脂奶的凍干保護(hù)劑,經(jīng)高壓滅菌。2～8℃保存?zhèn)溆谩?.1.4濃度抗生素溶液配制每mL含10萬單位的青、鏈霉素濃縮液,經(jīng)濾過除菌,無菌檢驗(yàn)陰性,冷凍保存?zhèn)溆谩?.1.5組織壓力機(jī)采用法國進(jìn)口或國產(chǎn)的組織搗碎機(jī),經(jīng)包裝高壓滅菌或以消毒酒精浸泡消毒后備用。1.2方法1.2.1材料的滲透試驗(yàn)首先將生產(chǎn)種毒稀釋100倍,然后將雞胚分為三組:第一組,正常生產(chǎn)組,仍采用雞胚尿囊腔接種法,每胚0.1mL;第二組,人工氣室絨毛尿囊膜接種法,每胚接種0.2mL;第三組,試驗(yàn)組,采用絨毛尿囊膜滲透法,每胚接種0.2mL。具體方法如下:在照蛋器幫助下,避開雞胚大血管(胎兒正面),劃出氣室的界限。靠近氣室界線處1cm左右劃出接種點(diǎn),涂碘脫碘后,打孔,取帶5號(hào)半針頭的1mL注射器抽取稀釋好的種毒液,順針孔垂直刺入雞胚尿囊腔中(刺破殼膜和絨毛尿囊膜),然后提起注射器使針頭懸于氣室中,噴灑注射種毒液,毒液直接接觸到刺破點(diǎn),滲透直接接觸感染殼膜下的絨毛尿囊膜,最后達(dá)到全胚感染。絨毛尿囊膜滲透法接種示意圖詳見參考文獻(xiàn)。1.2.2接種雞胚、照胚的制備參照《規(guī)程》,接種后,人工氣室絨毛尿囊膜接種的雞胚,將人工氣室絨毛尿囊面朝上,尿囊腔和絨毛尿囊膜滲透法接種的雞胚,氣室朝上直立放置。繼續(xù)于36.5～37℃靜止孵化。接種后24h第一次照胚,死胚棄掉,此后每隔4～6h照一次胚,死胚隨時(shí)取出于2～8℃冷卻處理。根據(jù)死胚數(shù)量分批集中解剖,以15個(gè)左右為一組收獲胎兒置于無菌容器中,作無菌檢驗(yàn)后于-20℃保存。1.2.3雞胚的誘導(dǎo)誘導(dǎo)將3種方法接種后收獲的死亡雞胚胎兒(頭部、四肢或全身具有典型充出血病痕)于組織搗碎機(jī)中研磨成組織勻漿,然后按規(guī)程中要求用無菌生理鹽水分別作10倍系列稀釋,取10-5～10-84個(gè)滴度,經(jīng)人工氣室絨毛尿囊膜接種10～11日齡SPF雞胚,每胚0.2mL。人工氣室面朝上,36.5℃繼續(xù)靜止孵化觀察至120h。其間每隔4～8h照蛋一次,死胚于2～8℃存放,記錄雞胚死亡情況,并解剖觀察其胎兒和絨毛尿囊膜的病變。最后計(jì)算ELD50/0.2mL。1.2.4成品凍干苗的制備根據(jù)半成品的病毒含量,將3種不同方法接種收獲的死胚胎兒(無菌檢驗(yàn)、效價(jià)檢驗(yàn)合格)經(jīng)組織搗碎機(jī)研磨成組織勻漿,然后,以1∶1的比例加入凍干保護(hù)劑并加入適量濃雙抗,凍干制備成成品凍干苗。隨機(jī)抽取樣品,參照《規(guī)程》用9～11日齡SPF雞胚檢測(cè)(ELD50/每羽)。2結(jié)果2.13絨尿囊膜滲透法接種雞胚的性能尿囊腔接種雞胚早死率為1.5%,不死率為12%;人工氣室絨毛尿囊膜接種雞胚早死率為15%,不死率為0;絨毛尿囊膜滲透法接種雞胚早死率為3.3%,不死率也為0;所有死亡雞胚胎兒都有不同程度的頭部、四肢乃至全身充出血癥狀(見表1)。2.2凍干苗的檢測(cè)3種接種方法收獲的死胚胎兒的ELD50/0.2mL的檢測(cè)結(jié)果差異不大,均在12.5左右,符合《規(guī)程》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。成品凍干苗樣品檢測(cè)(ELD50/羽)結(jié)果:尿囊腔途徑、人工氣室絨毛尿囊膜途徑和絨毛尿囊腔滲透途徑分別為105.3、105.7和105.5/羽。達(dá)到了《規(guī)程》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。3雞胚表面尿囊腔滲透接種法3.1本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)雞傳染性法氏囊炎病毒(B87株)是一種嗜膜性很強(qiáng)的病毒,尤其是對(duì)雞胚絨毛尿囊膜接種最為敏感。從接種雞胚死亡情況及胎兒和絨毛尿囊膜變化都可以說明經(jīng)兩種絨毛尿囊膜接種方法感染的雞胚,病毒血癥產(chǎn)生的時(shí)間早而且嚴(yán)重,接種死亡率為百分之百。3.2絨毛尿囊膜滲透法明顯優(yōu)于原有的尿囊腔接種法和人工氣室絨毛尿囊膜接種法。絨毛尿囊膜接種雞胚早死率低于人工氣室絨毛尿囊膜接種雞胚(低11.7個(gè)百分點(diǎn));盡管其早死率比尿囊腔接種法高出1.8個(gè)百分點(diǎn),但由于沒有不死雞胚,最終使雞胚利用率實(shí)際提高9.93個(gè)百分點(diǎn)。說明絨毛尿囊膜滲透接種法彌補(bǔ)了尿囊腔和人工氣室絨毛尿囊膜這兩種接種方法的不足。3.3根據(jù)《規(guī)程》要求,主要收獲感染的雞胚胎兒(或有病變的絨毛尿囊膜)作為配苗的半成品,如將種毒稀釋倍數(shù)適當(dāng)調(diào)整,使雞胚死亡高峰集中在90h左右則最為理想。此時(shí)雞胚較大,但胎兒尚未發(fā)育成熟,絨羽毛短而軟,胎兒骨骼鈣化也未最后完成,但病毒含量高,而且易于研磨,組織碎