分子間力對大豆蛋白凝膠形成及質(zhì)構(gòu)特性的影響

分子間力對大豆蛋白凝膠形成及質(zhì)構(gòu)特性的影響

大豆及其產(chǎn)品是中國的重要傳統(tǒng)食品。它有著悠久的歷史、高昂的營養(yǎng)價值和廣闊的發(fā)展前景。例如豆腐中含有人體所需的8種必需氨基酸，且具有高蛋白、低膽固醇的營養(yǎng)特點(diǎn)，經(jīng)常食用豆腐，可以降低血液中膽固醇的含量，減少動脈硬化的機(jī)會，同時對神經(jīng)衰弱和體質(zhì)虛弱的人有很大的利益，對高血壓、冠心病等患者在治療過程中也有一定的輔助療效作用。以豆腐和豆腐干為代表的豆制品不僅具有較高的營養(yǎng)價值，其中的大豆蛋白還有許多優(yōu)良的加工特性，凝膠特性就是大豆蛋白最為主要的功能特性之一。無論形成哪種凝膠，蛋白質(zhì)分子間的作用力無外乎以下幾種：一是共價鍵交聯(lián)，包括形成新的肽鍵和肽鏈間的二硫鍵；二是離子鍵，即肽鏈分子間正負(fù)電荷的吸引作用；三是肽鏈間的次級鍵作用，包括氫鍵和疏水作用。這些作用力需要克服肽鏈分子間的排斥力，如靜電斥力和位壘，當(dāng)這些作用力大于斥力時才能形成凝膠，否則不能。使用不同的凝固劑形成的大豆蛋白凝膠分子間作用不同，目前主要用間接手段研究蛋白質(zhì)凝膠過程中分子間的作用力。利用可以增強(qiáng)或削弱蛋白質(zhì)分子間作用力的試劑觀察凝膠特性的變化，如利用添加強(qiáng)的表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)可以破壞疏水作用，氯化鈉等高溶解度的鹽類可以破壞蛋白質(zhì)分子間的靜電引力。至今，已有較多研究報道了大豆蛋白的熱促凝膠能力以及一些環(huán)境因素對其凝膠能力或凝膠過程的影響。李里特等研究在豆腐加工過程中對豆腐凝膠形成起重要作用的幾個影響因素，研究發(fā)現(xiàn)豆?jié){的加熱條件、凝固條件和凝固劑的濃度對豆腐凝膠強(qiáng)度起到直接的作用。王飛鏑等研究以大豆蛋白為原料制備的水凝膠、CaCl2凝膠和乙醇凝膠的流變學(xué)性質(zhì)與吸水性。吳暉等通過動態(tài)振蕩測量考察了NaCl和CaCl2對商用大豆分離蛋白(SPI)熱誘導(dǎo)凝膠的膠凝過程及動態(tài)黏彈性的影響。然而，大多此類報道都是分別研究熱誘導(dǎo)膠凝和鹽誘導(dǎo)膠凝，而實(shí)際生產(chǎn)中，往往涉及幾種誘導(dǎo)因素的綜合應(yīng)用，例如在豆腐、豆腐干等大豆食品的生產(chǎn)中涉及到加熱和加鹽兩種誘導(dǎo)因素，關(guān)于這方面的報道比較少。本實(shí)驗(yàn)主要討論分子間作用力對多因素誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠體系的影響情況，以期對建立多因素誘導(dǎo)凝膠體系模型、加強(qiáng)傳統(tǒng)豆制品基礎(chǔ)研究以及大豆制品深加工和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)生重要影響。1材料和方法1.1分離蛋白有限公司大豆分離蛋白(SPI)山東禹王大豆分離蛋白有限公司；石膏(食品級)市售；氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、脲、氯化鈉均為分析純。1.2電子酸度計和多利斯科學(xué)儀器恒溫水浴鍋；PF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電子酸度計美國熱電公司；電子天平(e=10d)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀TextureAnalyser英國公司；NDJ-9S數(shù)顯黏度計上海精密科學(xué)儀器有限公司。1.3方法1.3.1凝膠的形成溫度影響SPI凝膠形成的因素主要包括SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、石膏用量，點(diǎn)漿溫度以及凝膠形成溫度等。通過單因素試驗(yàn)，平行對比確定蛋白凝膠形成的適宜條件為：SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，pH7.5，石膏用量8%，點(diǎn)漿溫度以及凝膠形成溫度均為80℃。1.3.2石膏黏度的測定分別準(zhǔn)確稱取3gSPI，溶解于25ml的蒸餾水中，并進(jìn)行標(biāo)記。用2mol/LNaOH溶液和1mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH7.5。攪拌均勻后，在電爐上加熱至沸騰后不停攪拌，煮沸2.5min后取下，將稱好的石膏加入5ml的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颉４齋PI溶液冷卻至80℃時，加入石膏溶液(終濃度為8%)，邊加邊攪拌，加入后不停的攪拌1min，最后杯口封上保鮮膜，放入到80℃恒溫水浴鍋中，計時。每隔20min取出樣品，用黏度計測其黏度。其中轉(zhuǎn)子型號：S-4#，轉(zhuǎn)速：12r/min。1.3.3在石膏硬化和spi過程中，分子間的靜電作用1.3.3.1.nacl對spi凝膠形成的影響根據(jù)1.3.1節(jié)中方法，加入不同濃度的NaCl溶液制備SPI凝膠，記錄凝膠形成情況。1.3.3.2.不同ph值對凝膠形成的影響根據(jù)1.3.1節(jié)中方法，將溶液pH值調(diào)至不同范圍，分別制備SPI凝膠，記錄凝膠形成情況。1.3.4質(zhì)構(gòu)特性根據(jù)1.3.1節(jié)中方法，分別加入不同濃度的SDS溶液，制備SPI凝膠，記錄凝膠形成情況并分別測定其質(zhì)構(gòu)特性。TPA測定條件為：測定模式和選項TPA；測定前探頭速度2.00mm/s；測定時探頭速度2.00mm/s；測定后探頭速度2.00mm/s；測定距離為凝膠厚度的30%；探頭兩次測定間隔時間3.00s；觸發(fā)類型為自動；觸發(fā)力5.0g；探頭型號P/6(直徑6mm)；數(shù)據(jù)攫取速率50.00pps。1.3.5不同濃度對spi凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響根據(jù)1.3.1節(jié)中方法，分別加入不同量的脲，使溶液中脲的終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6mol/L，制備SPI凝膠，記錄凝膠形成情況并測定其質(zhì)構(gòu)特性。TPA測定條件同1.3.4節(jié)。2結(jié)果與分析2.1凝膠的形成時間由圖1可以看出，在0～60min的過程中，隨著凝膠形成時間的不斷延長，SPI溶液的黏度緩慢增大；在60～100min的過程中，隨著凝膠形成時間的不斷延長，黏度明顯增大；在100～120min的過程中，隨著凝膠形成時間的不斷延長，黏度值逐漸趨于平緩并保持不變。黏性是分子運(yùn)動和分子間引力的體現(xiàn)，黏度的變化說明SPI在石膏的作用下分子間引力增加，導(dǎo)致體系分子間的內(nèi)摩擦力增加即黏度上升。黏度在接近凝固點(diǎn)時的變化明顯，說明存在分子結(jié)構(gòu)的變化或分子間作用力的增加。2.2在石膏硬化和spi過程中，分子間的靜電作用2.2.1nacl對肽鏈表面負(fù)電荷的影響如圖2所示，當(dāng)NaCl濃度在0～0.05mol/L范圍時，凝膠形成時間隨著NaCl濃度的增大而縮短，當(dāng)NaCl濃度超過0.05mol/L時，凝膠形成時間延長。大豆7S球蛋白的等電點(diǎn)是4.6，大豆11S球蛋白的等電點(diǎn)大約為5.0，因此，SPI帶凈的負(fù)電荷。大豆蛋白質(zhì)變性后，展開的肽鏈含有帶電荷的基團(tuán)，同性電荷基團(tuán)的產(chǎn)生靜電斥力阻礙肽鏈之間的相互結(jié)合，NaCl在低濃度時具有中和SPI表面負(fù)電荷，降低肽鏈間靜電斥力的作用，使得SPI分子間的靜電排斥力小于靜電吸引力，有利于肽鏈之間相互接近和凝聚，縮短凝膠形成時間。因此，NaCl的加入有利于中和大豆蛋白表面的負(fù)電荷，降低肽鏈間的靜電斥力，有利于肽鏈間相互接近和凝聚。凝固時間縮短，同時凝固強(qiáng)度增加。NaCl可以使蛋白質(zhì)水化作用增強(qiáng)，從而破壞蛋白質(zhì)分子間的次級鍵，因此，繼續(xù)增加NaCl的濃度時，蛋白質(zhì)的水化作用逐漸加強(qiáng)，使蛋白質(zhì)有向水中“溶解”的趨勢，這種趨勢又阻礙了蛋白質(zhì)分子間的凝聚，不利于凝膠的形成，使凝膠強(qiáng)度下降，凝固時間增加。這就說明離子鍵在熱凝膠和無機(jī)鹽凝膠的形成過程中起非常重要的作用，這與Kohyama等的報道一致。2.2.2ph值對豆腐凝膠的影響實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，pH值小于7.0時，產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，凝膠無法形成；而pH7.0～9.0時，凝膠形成時間隨著pH值的增大而縮短。本實(shí)驗(yàn)中，SPI受熱變性，肽鏈展開。當(dāng)pH值處于等電點(diǎn)時，SPI分子不帶電荷，分子之間的作用力大于與水的作用力，相互聚集沉淀；當(dāng)pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時，SPI分子帶有同種電荷，相互排斥力占主導(dǎo)，當(dāng)靜電排斥力與蛋白分子變性后暴露的疏水基團(tuán)之間的吸引力達(dá)到平衡時，凝膠形成。隨著pH值的增大，游離水量越少，形成的豆腐凝膠情況越好，但pH值過大會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性。結(jié)合NaCl對石膏凝固SPI的影響，可以得到這樣的結(jié)論：在石膏凝固SPI過程中離子鍵的作用較大，凝膠凝固過程需要克服蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力。2.3sds對凝膠保水性和硬度的影響如圖3所示，當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～0.5%時，隨著SDS的增加，SPI凝膠形成的時間明顯縮短，說明SDS有加速凝膠形成的作用。SDS是一種強(qiáng)的親水表面活性劑，這樣加入SDS后，可以破壞蛋白質(zhì)分子的疏水結(jié)合，有助于肽鏈的充分展開，疏水基團(tuán)的暴露，蛋白溶液的疏水性增大，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，凝膠形成時間縮短。另外溶液的疏水性的增大，有利于鏈間二硫鍵的形成，從而有助于凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。由表1可知，隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，形成凝膠的硬度顯著提高，并且呈現(xiàn)明顯的梯度。凝膠的彈性出現(xiàn)峰值，先增加后減小，SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)再增加，變化不大。黏附性產(chǎn)生較大波動，但還未發(fā)現(xiàn)其規(guī)律，有待進(jìn)一步研究。SDS對內(nèi)聚性的影響不明顯。凝膠硬度增大，而凝膠彈性降低，說明SDS的添加可以使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加牢固，分子間作用力增強(qiáng)。凝膠硬度反映了蛋白分子間相互作用的強(qiáng)弱和分子間的成鍵數(shù)目的多少，而凝膠彈性是對凝膠結(jié)構(gòu)在第一次下壓后破壞程度的反映。煮沸時，蛋白質(zhì)變性，空間結(jié)構(gòu)被破壞，肽鏈伸展，使疏水氨基酸殘基和疏水氨基酸側(cè)鏈暴露出來，肽鏈?zhǔn)杷栽黾?，使蛋白質(zhì)分子相互靠近，疏水基團(tuán)一致向內(nèi)聚集。SDS是一種強(qiáng)的親水表面活性劑，可以降低溶液表面張力。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示當(dāng)加入SDS時，凝膠形成時間縮短，推斷可能是因?yàn)樵赟DS作用下，蛋白質(zhì)分子迅速排列成有序狀，形成凝膠結(jié)構(gòu)。通過以上分析，可以得到這樣的結(jié)論：疏水作用對SPI形成凝膠是非常重要的作用力。2.4不同濃度哌對肽鏈間氫鍵形成的影響如圖4顯示，當(dāng)脲濃度在0～0.6mol/L時，隨著脲濃度的不斷增大，凝膠形成時間逐漸延長，當(dāng)脲濃度增大到0.6mol/L時，凝膠基本無法形成。大豆蛋白變性前肽鏈之間主要靠鏈間形成的氫鍵和肽鏈表面與水形成的氫鍵維持穩(wěn)定，另外，多肽主鏈上的羰基氧和酰氨氫之間、側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側(cè)鏈或主鏈肽基與水之間都可以形成氫鍵，煮沸后蛋白質(zhì)變性，肽鏈展開隨機(jī)排列，破壞了原來的氫鍵，原來形成氫鍵的基團(tuán)暴露，暴露的氫鍵基團(tuán)促進(jìn)展開的肽鏈相互聚集，氫鍵的結(jié)合使得肽鏈形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入一定濃度的脲后，脲與肽鏈間的氫鍵基團(tuán)結(jié)合，肽鏈上的氫鍵基團(tuán)被屏蔽，影響肽鏈間氫鍵的形成。這就表明隨著脲濃度的增大，脲對肽鏈間氫鍵形成的影響加大，從而導(dǎo)致凝膠形成時間的延長。由此可以看出氫鍵是大豆蛋白凝膠形成的分子間作用力之一，對大豆蛋白凝膠的形成有重要的影響。凝膠硬度主要反應(yīng)的是形成凝膠結(jié)構(gòu)的肽鏈間成鍵數(shù)的多少，肽鏈間成鍵數(shù)越多，硬度越大。本實(shí)驗(yàn)中，隨著脲濃度的增加，凝膠的硬度減小，并且呈現(xiàn)明顯的梯度變化，這說明，脲使氫鍵發(fā)生破壞。脲使凝膠彈性略有增加，但并不隨濃度增加而變化。脲使凝膠黏附性減小，內(nèi)聚性增加。結(jié)合脲對石膏凝固SPI凝固時間的影響進(jìn)行分析，氫鍵對SPI凝膠形成是非常重要的。3凝膠的形成過程大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成是蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)分子與水分子之間相互吸引與推持平衡的結(jié)果，這一過程主要是將蛋白肽鏈的疏水區(qū)域和巰基暴露，為豆腐凝膠的形成打下基礎(chǔ)。將生豆?jié){進(jìn)行熱處理使大豆蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性是豆腐凝膠形成的必要條件之一。前人曾經(jīng)提出SPI在最初加熱階段首先形成可溶性凝聚，繼續(xù)加熱，此可溶性凝聚相互締合形成宏觀聚集體，最后形成內(nèi)部結(jié)構(gòu)排列有序的凝膠空間網(wǎng)絡(luò)。大豆蛋白凝膠的形成主要依靠分子間的氫鍵、離子鍵、二硫鍵和疏水作用。其中疏水相互作用和氫鍵對大豆球蛋白凝膠的形成非常重要。本研究采用SPI模擬豆腐復(fù)合體系中凝膠形成的過程，探討分子間作用力對多因素誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠體系的影響情況，通過觀察認(rèn)為整個凝膠形成過程是肽鏈?zhǔn)紫染奂纬梢粋€膠核，然后展開的肽鏈逐漸依附，肽鏈分子有序連接，最終形成凝膠三