基于響應(yīng)面法優(yōu)化雞花青素提取工藝

基于響應(yīng)面法優(yōu)化雞花青素提取工藝

1材料和方法1.1儀器和設(shè)備廣州玉立寶科技有限公司；鹽酸、石油醚和丙酮的市場(chǎng)價(jià)格分析：。JB200-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌器、DS-1型高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;HH-S型恒溫油浴鍋金壇市富華儀器有限公司;himacCR22G型高速冷凍離心機(jī)日本日立公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ALPHA1-4型冷凍干燥機(jī)德國(guó)CHRIST公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;MM12型絞肉機(jī)廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1關(guān)于烏江的酶分解方法，參考文獻(xiàn)1.2.4不同處理法破碎油脂將抽濾分離出的黑色素分別用蒸餾水洗滌3次、石油醚洗2次、丙酮洗滌2次、蒸餾水洗滌2次,去除殘余油脂,每?jī)纱沃g洗滌液浸泡黑色素的時(shí)間為20min。1.2.7影響激素提取率的因素考察鹽酸濃度、鹽酸體積與黑色素渣體積比、油浴溫度、油浴時(shí)間4因素對(duì)黑色素的提取率的影響。選取影響較顯著的3個(gè)因素采用DX軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行分析,確定出最佳工藝。2鹽酸濃度對(duì)提取率的影響由圖1可知,鹽酸濃度由4mol/L增加至6mol/L時(shí),黑色素提取得率逐漸上升,并在6mol/L時(shí)提取得率達(dá)到峰值。當(dāng)鹽酸濃度高于6mol/L后,黑色素的提取得率反而下降?？赡茉蚴躯}酸濃度太高時(shí)導(dǎo)致了部分烏雞黑色素被破壞,從而使得黑色素的得率降低因此提取黑色素時(shí)應(yīng)選取的鹽酸進(jìn)行油浴,以獲得較高的得率。2.2不同激素渣體積對(duì)烏蘇葉案得率的影響由圖2可知,隨著鹽酸體積與黑色素渣體積比的增大,黑色素的得率先升高后降低,在鹽酸體積∶黑色素渣體積為2∶1時(shí),烏雞黑色素的得率最大?？赡茉蚴钱?dāng)鹽酸體積與黑色素渣體積比過大時(shí),提取所用鹽酸的量過大,導(dǎo)致反應(yīng)物濃度過稀,反而不利于反應(yīng)的進(jìn)行,進(jìn)而導(dǎo)致提取得率降低。因此,為了得到較高的黑色素得率,應(yīng)該選用鹽酸體積∶黑色素渣體積為2∶1進(jìn)行提取。2.3不同溫度對(duì)烏蘇葉色濾料提取率的影響由圖3可知,油浴溫度對(duì)烏雞黑色素的提取得率有較大影響。烏雞黑色素的提取得率隨著提取溫度的升高(100～105℃)有所上升,可能原因是由于烏雞黑色素與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合在一起,在100℃時(shí),溫度還不足以完全破壞黑色素與蛋白的締合鍵,所以得率較低。提取溫度為105℃時(shí),烏雞黑色素與蛋白質(zhì)的結(jié)合鍵被完全破壞,黑色素才游離出來(lái),使得提取得率最大。當(dāng)溫度超過105℃后,烏雞黑色素的提取得率反而下降,可能原因是溫度過高,破壞了游離出來(lái)的部分烏雞黑色素,導(dǎo)致得率有所下降。所以,出于最高提取得率考慮,應(yīng)該首選105℃作為油浴溫度。2.4油浴時(shí)間長(zhǎng)由圖4可知,隨著油浴時(shí)間的變化,烏雞黑色素的得率先升高后降低。在提取時(shí)間為14h時(shí),提取得率最大。在13h時(shí)提取得率較低,可能是由于油浴時(shí)間不夠長(zhǎng),導(dǎo)致黑色素與蛋白結(jié)合的鍵還沒有完全被破壞,黑色素沒能徹底游離出來(lái);在14h時(shí),由于黑色素與蛋白結(jié)合的鍵完全被破壞,黑色素完全游離出來(lái),所以得率最大。當(dāng)油浴時(shí)間過長(zhǎng),黑色素的提取得率反而降低,可能是由于油浴時(shí)間過長(zhǎng),導(dǎo)致部分黑色素被破壞,提取得率降低。在18h時(shí)黑色素的提取得率反而升高,可能是由于實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致。因此,綜合考慮,油浴時(shí)間應(yīng)該選擇14h。2.5反應(yīng)分析對(duì)黑色素提取的優(yōu)化2.5.1油浴溫度和鹽酸與渣體積比對(duì)激素得率的影響根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),選擇油浴溫度、鹽酸濃度和鹽酸與渣體積比3個(gè)因素,以黑色素得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法在3因素3水平上對(duì)烏雞黑色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表略。由響應(yīng)面軟件Design-Expert7.0得到的分析結(jié)果可知;R2=0.9774、失擬項(xiàng)不顯著(0.0761>0.05),說明回歸方程的擬合程度較好,模型是顯著的?；貧w模型的F-檢驗(yàn)顯著,說明所擬合的二次回歸方程合適,該模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較接近(如圖5)。以黑色素得率為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后,各因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用下面回歸方程表示:由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X12對(duì)黑色素的得率有比較顯著的影響,而其他因素的影響相對(duì)較小。油浴溫度和鹽酸與渣體積比之間的交互作用如圖7所示,比較在相同鹽酸與渣體積比條件下油浴溫度對(duì)黑色素得率的影響可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽酸與渣體積比較小時(shí),黑色素的得率隨著油浴溫度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì);而當(dāng)鹽酸與渣體積比較大時(shí),黑色素的得率隨著油浴溫度的增加也是呈先增加后減小的趨勢(shì),但變化并無(wú)鹽酸與渣體積比較低時(shí)劇烈?？赡苡捎谟驮囟鹊陀谧钸m酸解溫度時(shí),隨溫度的增加,酸解反應(yīng)更加充分,黑色素的得率逐漸升高。當(dāng)油浴溫度超過最適酸解溫度時(shí),高溫對(duì)黑色素的破壞導(dǎo)致其得率反而降低。在相同的油浴溫度下,黑色素的得率隨著鹽酸與渣體積比的增大而逐漸增大。但在鹽酸與渣體積比較小時(shí),黑色素的得率變化較為顯著,而在鹽酸與渣體積比較大時(shí)黑色素得率的增加趨于平緩,其原因可能是鹽酸與渣體積比較大時(shí),鹽酸的量已經(jīng)超過最佳值,因而致使變化并不如鹽酸與渣體積比較小時(shí)顯著。鹽酸與渣體積比與油浴溫度之間存在協(xié)同關(guān)系,在油浴溫度105℃左右,稍微升高油浴溫度的同時(shí)適當(dāng)增加鹽酸與渣體積比就能進(jìn)一步提高黑色素的得率。鹽酸濃度和鹽酸與渣體積比之間的交互作用如圖8所示,在不同的鹽酸濃度下,鹽酸與渣體積比對(duì)黑色素的得率影響趨勢(shì)基本相同。隨著鹽酸與渣體積比的增大,黑色素的得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在鹽酸濃度較低時(shí),黑色素的得率隨著鹽酸與渣體積比的增大增加較為平緩;在鹽酸濃度較高時(shí),黑色素的得率隨鹽酸與渣體積比的增大增加得更為顯著。當(dāng)鹽酸與渣體積比較小時(shí),黑色素的得率隨著鹽酸濃度的增大變化較為平緩,呈先減小后增大的趨勢(shì);當(dāng)鹽酸與渣體積較大時(shí),黑色素的得率隨著鹽酸濃度的增大變化較為顯著,呈逐步增大的趨勢(shì)。鹽酸濃度與鹽酸與渣體積比之間存在協(xié)同作用,在增大鹽酸濃度的同時(shí),于最佳鹽酸與渣體積比范圍內(nèi)稍微增大體積比就能較顯著地提高黑色素的得率。2.5.3油浴提取烏蘇烷的最佳條件為了進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)的值,對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零,得X1=1.0281,X2=-0.5374,X3=-0.3270,即油浴提取烏雞黑色素的最佳條件為:油浴溫度103.3650℃、鹽酸濃度5.7313mol/L、鹽酸與渣體積比1.8365,在此條件下,烏雞黑色素的得率理論值可達(dá)6.56‰。2.5.4油浴最佳條件的確定為了檢驗(yàn)RSM分析的可靠性,采用上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行接枝實(shí)驗(yàn),同時(shí)考慮實(shí)際操作的便利,將油浴提取烏雞黑色素的最佳條件修正為:油浴溫度103℃、鹽酸濃度5.7mol/L、鹽酸與渣體積比1.8,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次,得測(cè)定值為6.32‰,預(yù)測(cè)值為6.38‰。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值誤差在1%以內(nèi),證明優(yōu)化結(jié)果可信,具有實(shí)用價(jià)值。3烏蘇氏酶解法提取思想本文在研究烏雞黑色素提取時(shí)各因素對(duì)提取得率的影響的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法對(duì)烏雞黑色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化最優(yōu)工藝條件為油浴溫度103℃、鹽酸濃度5.7mol/L、鹽酸與渣體積比1.8,利用最優(yōu)條件提取烏雞黑色素,提取得率為6.32‰,與響應(yīng)面模型所預(yù)測(cè)的提取得率6.38‰十分接近,驗(yàn)證了響應(yīng)面模型的強(qiáng)大分析功能,并為烏雞黑色素的提取提供了理論依據(jù)。烏雞(WhiteSilkieBantams)是聞名中外的藥用家禽,具有特殊的藥用、營(yíng)養(yǎng)及觀賞價(jià)值。烏雞在表型性狀上與普通雞最明顯的差異是體內(nèi)含有大量黑色素。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,烏雞黑色素有清除自由基和抗氧化作用,可以抗衰老,提高免疫力。因此,如何有效地提取烏雞黑色素便成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。袁纓曾經(jīng)對(duì)烏雞黑色素的提取進(jìn)行過研究,但是該法需回流長(zhǎng)達(dá)50h,耗能太大。蔡華珍曾用酸性蛋白酶于低酸環(huán)境下酶解20h后,直接用石油醚、水洗滌后凍干為成品,但是該法只用酶解,而且酶解時(shí)間太長(zhǎng),后期的酶活已經(jīng)下降,很難確保蛋白被酶解完全,黑色素的純度亦很難保證。鑒于這些不足,本文首創(chuàng)利用改進(jìn)的酶解與鹽酸回流相結(jié)合的方法,對(duì)烏雞黑色素進(jìn)行了提取,并研究了鹽酸濃度、鹽酸體積與黑色素渣體積比、油浴溫度、油浴時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響,進(jìn)而采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。1.2.2黑色素的初步分離將酶解液離心后可得上中下三層,把上層和下層收集備用。1.2.3油浴將粗分離含黑色素渣加入一定濃度的鹽酸后,于恒溫油浴鍋內(nèi)油浴一定時(shí)間之后,抽濾分離出黑色素。1.2.5冷凍干燥將已經(jīng)洗滌干凈的樣品置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥40h后,取出稱重,計(jì)算得率。1.2.6提取得率的計(jì)算2.1鹽酸濃度對(duì)黑色素得率的影響2.5.2油浴溫度對(duì)血藥濃度的影響油浴溫度和鹽酸濃度之間的交互作用如圖6所示,油浴溫度較低時(shí),烏雞黑色素的得率隨著鹽酸濃度的變化不明顯,這可能是由于油浴溫度低于蛋白酸解的最佳作用溫度時(shí),鹽酸未能將烏雞蛋白充分酸解;當(dāng)油浴溫度升高到酸解最佳溫度范圍時(shí),黑色素的得率隨著鹽酸濃度的增加而顯著增加;當(dāng)油浴溫度高于蛋白酸解的最佳溫度范圍時(shí),黑色