雞脂肪酸結(jié)合蛋白基因克隆及初步表達分析

雞脂肪酸結(jié)合蛋白基因克隆及初步表達分析

在現(xiàn)代雞生產(chǎn)中，90%以上的商品雞是混合雞。通過品種間雜交、配套系雜交等方式獲得的商品代肉雞體型整齊、肉用性能好,但雜種雞腹脂和皮下脂肪含量過高問題卻日顯突出。適當(dāng)?shù)闹緝錇殡u的正常生理及代謝所必需,但腹部和皮下脂肪沉積過多則不利于雞的生長發(fā)育且增加飼料消耗。脂肪酸結(jié)合蛋白(Fattyacidbindingprotein,FABPs)是一族小分子細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì),含126~134個氨基酸序列。FABPs廣泛存在于各種動物組織中,與長鏈脂肪酸有較高親和力,對脂肪酸的氧化、脂化和代謝起重要作用。迄今已發(fā)現(xiàn)15種類型的FABPs,肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)是最早發(fā)現(xiàn)的FABP,也稱FABP1。目前報道較多的是心型FABP(H-FABP)、脂肪型FABP(A-FABP)和細(xì)胞外FABP(Ex-FABP)。對大鼠的研究發(fā)現(xiàn),H-FABP和A-FABP是影響肌間脂肪含量的重要基因。Gerbens等對豬H-FABP基因的研究發(fā)現(xiàn),不同基因型個體的肌間脂肪含量差異顯著,并認(rèn)為H-FABP基因可能是影響豬肉肌間脂肪沉積的主效基因。對雞的研究發(fā)現(xiàn),Ex-FABP基因的單核苷酸多態(tài)性與腹脂性狀相關(guān)顯著[5~8]。L-FABP的功能研究主要集中在人與小鼠。對小鼠的研究表明,L-FABP與不飽和脂肪酸的協(xié)同作用可有效促進細(xì)胞的生長和分化。L-FABP還參與胰島素信號傳導(dǎo),促進血紅素和硒的代謝,以及甾醇的合成。Schroeder等研究發(fā)現(xiàn),L-FABP基因的表達與胚胎干細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。近年來對小鼠的研究表明,L-FABP與H-FABP、A-FABP相似,對直鏈和支鏈脂肪酸的吸收和代謝起重要作用。目前有關(guān)雞L-FABP基因的相關(guān)報道較少。Wang等研究發(fā)現(xiàn),雞L-FABP基因為組織特異性表達基因,只在肝臟及小腸部位表達。通過關(guān)聯(lián)分析顯示,雞L-FABP基因的單核苷酸多態(tài)位點與中國農(nóng)大CAU-F2雞群的腹脂重及腹脂率呈顯著相關(guān),表明L-FABP基因可能是雞腹脂性狀的候選基因或與其主效基因連鎖。為尋找與雜種雞脂肪性狀表達密切相關(guān)的基因,本研究以純種絲羽烏雞、農(nóng)大褐蛋雞及其正反雜交組合雞為試驗對象,分析了8周齡雜種雞的腹脂重、肌間脂寬等性狀與雙親均值的差異,通過mRNA差異顯示技術(shù)(DifferentialDisplayRT-PCR,DDRT-PCR)及測序獲得了在雜種雞中高表達的雞L-FABP基因,利用Northern雜交等方法驗證了L-FABP基因在雜種雞肝臟組織中的高表達現(xiàn)象,進而對雞L-FABP基因表達量與雜種雞脂肪沉積性狀間的關(guān)系進行了探討和分析。1材料和方法1.1雜交組合cd和dc以純種絲羽烏雞(Silkie,CC)、農(nóng)大褐蛋雞(CAUBrown,DD)及其正反雜交組合(CD和DC)為材料,每個組合200余只雞,公母各半,相同條件飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家家禽性能測定中心。至8周齡,分別從4組雞中隨機抽取30只健康公雞進行屠體性能測定,并從每組雞中隨機抽取8只采集新鮮肝臟組織,置于液氮速凍后再凍存于–80℃?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1dna的合成肝臟組織的總RNA用TRIZOLkit提取(參照Invitrogen公司提供的方法)?？俁NA純化后,每個組合8個樣本的總RNA等量混合建RNA池。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,反應(yīng)體系20μL,包括:0.5μg總RNA池,50mmol/LTris-HCl(pH8.3),40mmol/LKCl,7mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,20mmol/LdNTP,200pmol/L的3′錨定引物(HT11A:5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′)。反轉(zhuǎn)錄條件為,65℃5min,37℃10min后加入100U的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega),37℃繼續(xù)溫育1h,75℃5min。1.2.2dntp的制備DDRT-PCR反應(yīng)體系為20μL,包括2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,10mmol/LTris-HCl(pH9.0),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,20mmol/LdNTP,200pmol/L3′錨定引物(HT11A:5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′),200pmol/L5′引物(簡并引物GF-1:5′-GAGT\CCCA\GGACATTGAGCAG-3′),1UTaqDNA聚合酶(Promega)。反應(yīng)條件為,94℃預(yù)變性5min,前25個循環(huán)94℃30s,40℃60s,72℃90s,后15個循環(huán)94℃30s,52℃60s,72℃90s,最后72℃延伸7min。DDRT-PCR擴增產(chǎn)物檢測用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(39:1)電泳,銀染法顯色。1.2.3差異片段的回收銀染顯色后立即從PAGE膠上切下差異表達片段,裝入1.5mL滅菌eppendorf管,加入100μLNaI溶液,1/30體積TBE,37℃搖床振蕩2~3h,再用Glassmilk試劑盒(Bio101)方法回收差異片段。回收產(chǎn)物用于二次PCR擴增,擴增條件與第一次PCR條件一致,擴增產(chǎn)物用Glassmilk試劑盒回收。二次擴增產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞克隆,用DyeTerminatorCycleSequencingKit進行測序反應(yīng),在ABIPrism377DNA測序儀進行正反向測序。1.2.4半定量rt-pcr擴增利用地高辛標(biāo)記試劑盒(Roche公司),將含目的基因片段的重組質(zhì)粒標(biāo)記為探針,與點于尼龍膜上的4個組合雞肝臟cDNA(50ng)進行反向Northern雜交,雜交步驟參照試劑盒方法進行。根據(jù)本研究獲得的雞L-FABP基因的cDNA序列設(shè)計一對特異性引物,同時選用組成型表達基因GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)作為內(nèi)參照,進行半定量RT-PCR擴增。其中,目的基因L-FABP上游引物序列為:5′-GCAGAATGGGAATAAGTTC-3′;下游引物:5′-ATTCTCTTGCTAATTCTCTTG-3′。內(nèi)參照基因GAPDH的上游引物:5′-TCACAAGTTTCCCGTTCTCA-3′;下游引物:5′-GGAACACTATAAAGGCGAGAT-3′。半定量RT-PCR反應(yīng)體系25μL,包括1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,10mmol/LTris-HCl(pH9.0),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,20mmol/LdNTP,目的基因L-FABP及內(nèi)參照基因GAPDH的上、下游引物各200pmol/L,1UTaqDNA聚合酶(Promega)。目的基因和內(nèi)參照基因的擴增循環(huán)數(shù)均確定為指數(shù)擴增期內(nèi)的第23個循環(huán),擴增條件為,94℃預(yù)變性5min,94℃30s,52℃30s,72℃45s,循環(huán)數(shù)23,72℃延伸7min,最后4℃保存。1.2.5各性狀優(yōu)勢率收集8周齡CC、DD、CD及DC四組雞30只公雞的屠體性能測定數(shù)據(jù),對腹脂重、肌間脂寬、胸肌重、腿肌重、翅重、半凈膛重、全凈膛重、體斜長、脛骨長等9個性狀的雜種優(yōu)勢進行分析,各性狀雜種優(yōu)勢率計算公式為:性狀雜種優(yōu)勢率(%)=((性狀雜種表型–親本均值)/親本均值)×100。2結(jié)果與分析2.1雞l-fabp基因的擴增與同源性分析DDRT-PCR電泳圖譜顯示,8周齡絲羽烏雞(CC)、農(nóng)大褐蛋雞(DD)及其正反雜交組合雞CD和DC肝臟組織含一條差異表達的片段(圖1A)?？梢钥闯?雜交組合CD、DC及純種農(nóng)大褐DD均有一條約300bp的擴增片段,另一親本絲羽烏雞CC該片段擴增不明顯。對此差異表達片段進行回收克隆及測序,發(fā)現(xiàn)該片段與雞肝臟cDNA庫中的EST及cDNA序列(AW198465、EU049889、AF380999和AF563636)高度同源?；诖?根據(jù)人與雞的高度保守區(qū)設(shè)計引物,擴增出雞L-FABP基因的cDNA序列517bp,該序列包含雞L-FABP基因的全長cDNA編碼序列,共計381bp。序列比對表明,雞L-FABP基因與人L-FABP基因的同源性為73.44%。據(jù)cDNA開放閱讀框序列翻譯氨基酸,雞L-FABP基因共編碼127個氨基酸,與人的氨基酸序列比對顯示,二者同源性為70.08%。向GenBank提交雞L-FABP基因的全長cDNA編碼序列及氨基酸序列(GenBank登錄號:AY321365)。2.2重組質(zhì)粒的制備為驗證DDRT-PCR中發(fā)現(xiàn)的L-FABP基因在4個組合雞肝臟組織中確實存在差異表達,本研究首先進行了反Northern雜交驗證。其中探針為含有L-FABP基因片段的重組質(zhì)粒,膜上為4個組合雞的cDNA,并以制備探針的重組質(zhì)粒為陽性對照(+)進行雜交(圖1B)。雜交結(jié)果與DDRT-PCR結(jié)果相似,表現(xiàn)為雜交組合雞DC、CD的L-FABP基因表達量高于親本純種雞DD和CC的表達量。再以雞L-FABP基因的特異引物進行半定量RT-PCR驗證,結(jié)果如圖1C顯示,雜交組合雞CD和DC的L-FABP基因表達量(相對于GAPDH分別為1.357、1.4)高于親本純種CC及DD(相對于GAPDH分別為1.174、0.907)的表達量。進一步驗證了L-FABP基因在雜種雞CD、DC肝臟組織中的表達量高于親本純種雞CC和DD的表達量。2.3粗魚血食蛋白的表型八周齡雞的屠體性能雜種優(yōu)勢分析結(jié)果表明,除翅重外,雜種雞CD和DC的各項屠體性狀表型均高于親本絲羽烏雞CC及農(nóng)大褐蛋雞DD的均值。其中,雜種雞CD、DC的腹脂重超出雙親均值最高,雜種優(yōu)勢率分別達70.53%和41.41%,肌間脂寬也較高,雜種優(yōu)勢率分別為21.31%和8.2%,比其余6個屠體性狀高出約2~16倍(表1)。3l-fabp基因絲羽烏雞(CC)是我國著名本地雞品種,其肉及蛋在抗氧化、抗衰老及滋陰補氣等方面具有獨到功效。農(nóng)大褐蛋雞(DD)是我國自主培育的蛋雞品種,具有適應(yīng)性強、耗料少、產(chǎn)蛋多等特性。本研究通過這兩個品種的正反雜交試驗發(fā)現(xiàn),雜種雞CD、DC的腹脂重和肌間脂寬比雙親均值高8.2%~70.53%,這與肉雞生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的雜種雞存在腹脂和皮下脂肪含量過高的現(xiàn)象一致。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABPs)是FABPs家族成員之一,在長鏈脂肪酸的運輸、代謝、細(xì)胞膜磷脂構(gòu)建及機體能量供應(yīng)等方面具有重要作用[9~14]。適量表達的長鏈脂肪酸為動物機體所需,而表達水平過高時,則對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,L-FABPs可與這些有潛在毒力的長鏈脂肪酸相結(jié)合,或者將它們運輸?shù)骄€粒體以氧化降解,或者將之運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)等儲脂器官沉積下來。最近,Martin等對L-FABP基因敲除小鼠的研究表明,敲除L-FABP基因會引發(fā)小鼠肥胖癥,且為年齡和食物依賴型肥胖癥。與年齡和食物密切相關(guān)的人的肥胖癥也發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象。據(jù)Spann等報道,小鼠L-FABP與甘油三脂轉(zhuǎn)移蛋白(triglyceridetransferprotein)協(xié)同作用,促進脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三脂,并使油脂轉(zhuǎn)化為極低密度脂蛋白(VLDL)。本研究發(fā)現(xiàn),雞肝臟組織L-FABP的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)與人和大鼠的L-FABP極為相似,與Sewell等研究結(jié)果一致。Wang等研究結(jié)果表明,雞L-FABP基