全蝎乙醇提取物對(duì)耐苯妥英鈉大鼠驚厥模型的抗耐藥作用

全蝎乙醇提取物對(duì)耐苯妥英鈉大鼠驚厥模型的抗耐藥作用

癲癇是神經(jīng)退行性神經(jīng)疾病的常見疾病，是由多種原因引起的臨床綜合征?？拱d癇西藥雖可使80%患者得以控制,但仍有約20%～30%的病例接受合理的抗癲癇西藥治療后復(fù)發(fā),稱之為難治性癲癇(refractoryepilepsy,RE)。目前有關(guān)P-gp在難治性癲癇耐藥機(jī)制中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)。雖然已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道多種抗癲癇西藥為P-gp的底物,但對(duì)動(dòng)物中藥抗耐藥作用的基礎(chǔ)研究項(xiàng)目不多,為此從動(dòng)物中藥中尋找P-gp抑制劑將希望有所突破。全蝎的活性成分適用于熱盛風(fēng)動(dòng)所致的痙攣抽搐等證。本課題取全蝎乙醇提取物為研究對(duì)象,采用電刺激大鼠皮層點(diǎn)燃的耐苯妥英鈉驚厥模型,以驚厥閾值和癇性放電為判斷藥效指標(biāo),設(shè)維拉帕米為陽性對(duì)照,觀察全蝎乙醇提取物對(duì)大鼠局限性驚厥發(fā)作閾值、發(fā)作程度及mdr1mRNA和P-gp表達(dá)的影響,判定全蝎乙醇提取物對(duì)耐藥驚厥大鼠的對(duì)抗作用,探討其抗耐藥機(jī)制。1材料表面1.1g.動(dòng)物驅(qū)動(dòng)動(dòng)物致健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)健康清潔級(jí)Wistar大鼠,雌性,體重180～200g,動(dòng)物合格證號(hào)314第070102號(hào),單籠喂養(yǎng);山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,符合國家健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由攝食及飲水,自然光照射,換氣扇通風(fēng)。1.2全蟹乙醇提取物sae的制備全蝎為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥蟲體,購于山西省藥材公司,經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系天然藥化教研組楊官娥教授鑒定。提取:生藥材研碎,加入相當(dāng)于藥材量4倍體積的50%乙醇,浸泡24h;用回流方法加熱煎煮3次,每次0.5h,紗布過濾,合并3次濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(濃縮溫度70℃,壓力7.5mPa)濃縮成200%溶液,即得全蝎乙醇提取物(SAE)置冰箱冷藏備用。苯妥英鈉(phenytoinsodium,PHT),江蘇省鹽城制藥廠,批號(hào)950305;維拉帕米(verapamil,Ver),上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠,批號(hào)050101。1.3引物、試劑與材料總RNA提取試劑盒(SangonRNAKit),一步法PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver3.0,Mdrl上游引物5′-GGACAGAAACAGAGGATCGC-3′,下游引物5′-CCCGTCTTGATCATGTGGCC-3′,GAPDH上游引物5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′,下游引物5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′,均購自上海生物化學(xué)試劑公司。免疫組化試劑:P-gp多克隆抗體(兔抗鼠),即用型SABC免疫組化試劑盒,均由武漢博士德生物工程有限公司提供。1.4pcr擴(kuò)增及電泳檢測(cè)JY-Ⅰ型驚厥閾值自動(dòng)測(cè)定儀(山西醫(yī)科大學(xué)、太原理工大學(xué)聯(lián)合研制);江灣I型C腦立體定向儀(上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠);PT-100型PCR擴(kuò)增儀(美國MJResearch公司);JY-600+型電泳儀(北京東方君意電泳設(shè)備公司);TanonGIS-2009型紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能國際有限公司);光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)),BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。2方法2.1海蘭環(huán)境耐藥實(shí)驗(yàn)大鼠42只,除正常鼠6只外,其余36只,腹腔注射20%烏拉坦0.7g·kg-1麻醉。將大鼠頭部固定于立體定向儀上。無菌條件下暴露顱骨,準(zhǔn)確讀出X,Y,Z三維坐標(biāo),仿Voskuyl的方法,按Konig定位圖譜于前囟后1.0mm、左右各旁開3.0mm,各鉆一小孔,安放不銹鋼電極,自凝牙托粉及502膠封固。術(shù)后每日后肢肌肉注射青霉素1萬U/只,連用3d,以預(yù)防感染,休息7d開始大腦皮層電刺激。刺激參數(shù):強(qiáng)度在15s內(nèi)從0增大至1000μA的電流;波寬2ms,波形為單相斜坡梯形雙極脈沖。刺激至大鼠出現(xiàn)部分發(fā)作-繼發(fā)全身性發(fā)作(發(fā)作分為5級(jí):Ⅰ級(jí):自發(fā)活動(dòng)停止、不動(dòng)、閉眼;Ⅱ級(jí):須顫、節(jié)律性點(diǎn)頭,咀嚼伴有面部抽搐;Ⅲ級(jí):壓低頭部,急速后退;Ⅳ級(jí):前肢或后肢痙攣抬起、站立;Ⅴ級(jí):肢體陣攣、摔倒、翻滾、軀干強(qiáng)直)。以刺激大鼠至剛出現(xiàn)前肢或后肢痙攣抬起、站立、摔倒(Ⅳ-Ⅴ級(jí))時(shí)的電流強(qiáng)度(μA)為驚厥閾值(thresholdforlocalizedseizureactivity,TLS),作為判斷藥效的指標(biāo)。將TLS值穩(wěn)定大鼠隨機(jī)分出6只,作為驚厥模型組,給予生理鹽水灌胃(ig)。其余大鼠ig苯妥英鈉(PHT)0.154g·kg-1·d-1。每次給藥后1h用前述同樣刺激參數(shù)和方法刺激。記錄每次刺激后TLS,取3次TLS的均值作為本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的驚厥閾值。當(dāng)igPHT后各大鼠TLS值下降并穩(wěn)定至藥前水平,與給PHT前TLS值相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)可判定驚厥大鼠對(duì)苯妥英鈉產(chǎn)生耐藥,提示耐藥驚厥模型建立成功。否則同時(shí)增加PHT給藥和刺激次數(shù),直到100%動(dòng)物對(duì)PHT產(chǎn)生耐藥為止。2.2拉格爾克氏體醇vpcg實(shí)驗(yàn)共設(shè)6組,每組6只大鼠。正常組,給予等容積生理鹽水(NS);驚厥模型組(CMCG),給予等容積NS;苯妥英鈉耐藥驚厥模型組(PRCG),給予等容積NS+PHT0.154g·kg-1;維拉帕米陽性藥組(VPCG),Ver0.0385g·kg-1+PHT0.154g·kg-1;全蝎乙醇提取物低劑量組(SAE1),SAE6.5g·kg-1+PHT0.154g·kg-1;全蝎乙醇提取物高劑量組(SAE2),SAE13.0g·kg-1+PHT0.154g·kg-1;均采用ig給藥。藥后1h用上述刺激參數(shù)刺激,記錄各鼠TLS值。2.3rt-pcr反應(yīng)一步法給藥后24h快速斷頭取腦,冠狀面切取刺激電極周圍組織,迅速放入液氮中凍存?zhèn)溆?。按文獻(xiàn)進(jìn)行總RNA的提取和完整性鑒定。RT-PCR反應(yīng)按一步法PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作。配置瓊脂糖凝膠并進(jìn)行點(diǎn)樣及電泳,將所得凝膠置于紫外自動(dòng)成像系統(tǒng),啟動(dòng)自動(dòng)分析軟件,記錄目的基因擴(kuò)增條帶的灰度值(IA),并計(jì)算各樣本mdr1基因的IA與內(nèi)參基因gapdh的IA的比值(mdr1/gapdh),以此比值作為mdr1基因mRNA表達(dá)的相對(duì)量。2.4免疫組織化學(xué)藥后24h開顱取腦,切取電刺激周圍大腦皮質(zhì)區(qū),于4%多聚甲醛中浸泡24h,石蠟包埋。按SABC免疫組化試劑盒操作測(cè)定。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,同步進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)染色。光鏡下(×250)對(duì)各組大鼠腦組織切片中免疫組化陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),每一腦片任取6個(gè)視野并計(jì)數(shù)每個(gè)視野中表達(dá)P-gp的陽性細(xì)胞數(shù),然后取其陽性細(xì)胞數(shù)平均值(xˉ±s)(xˉ±s)作為各組大鼠腦內(nèi)P-gp的表達(dá)量。2.5樣本均數(shù)比較所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以xˉ±sxˉ±s表示,多樣本均數(shù)比較采用方差分析的L-S-D方法做兩兩比較。數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3結(jié)果3.1是否誘導(dǎo)驚厥模型42只大鼠,除正常鼠6只,術(shù)后死亡2只,實(shí)驗(yàn)過程中電極脫落4只被棄除外,其余30只大鼠隨著刺激電流強(qiáng)度的增加,大鼠依次出現(xiàn)如下行為反應(yīng):自發(fā)活動(dòng)停止、不動(dòng)、閉眼;須顫、節(jié)律性點(diǎn)頭,咀嚼伴有面部抽搐;壓低頭部,急速后退;站立并伴有兩側(cè)前肢的陣攣;陣攣嚴(yán)重,摔倒、軀干強(qiáng)直。首次電刺激大腦皮層,大鼠的平均驚厥閾值較高,刺激第1～10天逐日迅速下降且日趨穩(wěn)定。至10～14d,實(shí)驗(yàn)鼠TLS值趨于穩(wěn)定,提示驚厥模型制備成功。30只驚厥大鼠除6只作為驚厥模型組外,其余24只驚厥大鼠灌胃苯妥英鈉。首次給予PHT后電刺激大鼠皮層TLS值較igPHT前和驚厥模型組顯著升高(P<0.01)。連續(xù)給藥至第7天,TLS值明顯下降,分別與igPHT前和驚厥模型組TLS值比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示耐藥驚厥模型制備成功(表1)。3.2非典型癲癇發(fā)作3.2.1對(duì)藥物主導(dǎo)型結(jié)構(gòu)的影響驚厥模型組與耐苯妥英鈉驚厥模型組驚厥閾值相近,組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;3個(gè)用藥組的驚厥閾值由高至低依次為:全蝎乙醇提取物高劑量組>維拉帕米組>全蝎乙醇提取物低劑量組,分別與耐苯妥英鈉驚厥模型組相比驚厥閾值均升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)均有差異(P<0.05),但3個(gè)給藥組之間相互比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。3.2.2對(duì)大鼠mdr1mrna表達(dá)的影響半定量分析各組大鼠腦內(nèi)mdr1mRNA結(jié)果表明,驚厥模型組大鼠的mdr1mRNA表達(dá)量雖然比正常組在數(shù)值上增高,但組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;耐苯妥英鈉驚厥模型組大鼠的mdr1mRNA表達(dá)量比驚厥模型組明顯增高,統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(P<0.01)。全蝎乙醇提取物高、低劑量組大鼠的mdr1mRNA表達(dá)量均低于耐苯妥英鈉驚厥模型組,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01);維拉帕米組mdr1mRNA表達(dá)量亦較耐苯妥英鈉驚厥模型組低,與耐苯妥英鈉驚厥模型組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);維拉帕米組mdr1mRNA表達(dá)量分別與全蝎乙醇提取物高、低劑量組相比,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。3.2.3各組p-gp表達(dá)情況比較光鏡下正常大鼠皮層及海馬組織切片復(fù)染后細(xì)胞核染成均一的藍(lán)色;表達(dá)P-gp的陽性細(xì)胞可同時(shí)顯示有棕黃色的陽性表達(dá),主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),整個(gè)細(xì)胞的形狀都可以被完整表現(xiàn)出來(圖3)?？瞻捉M大鼠皮層及海馬內(nèi)有少量細(xì)胞表達(dá)P-gp,包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管周圍內(nèi)皮細(xì)胞。神經(jīng)元陽性染色顯示胞體呈圓形,帶有一條長長的突起。膠質(zhì)細(xì)胞陽性表現(xiàn)胞體形狀多樣,可以為三角形、橢圓形、不規(guī)則形,細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)均可表現(xiàn)陽性染色。與正常組相比,模型對(duì)照組P-gp陽性染色細(xì)胞數(shù)增多,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;耐藥模型組P-gp陽性細(xì)胞染色數(shù)較模型組明顯增多,差異顯著(P<0.01);全蝎乙醇提取物高、低劑量組的P-gp陽性細(xì)胞數(shù)均低于耐苯妥英鈉驚厥模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01);陽性藥維拉帕米組P-gp陽性染色細(xì)胞數(shù)亦較耐苯妥英鈉驚厥模型組低,組間比較有顯著性差異(P<0.01);維拉帕米組P-gp陽性細(xì)胞數(shù)分別與全蝎乙醇提取物高、低劑量組相比,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。4抗耐藥藥物作用全蝎可熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載全蝎具有抗癇之功效。研究證明,全蝎蝎毒是抗癲癇的主要有效部位,從中提純的抗癲癇肽(anti-epilepsypetide,AEP)作用更強(qiáng)。劉崇銘等研究證明,蝎毒及抗癲癇肽(AEP)對(duì)咖啡因、美解眠、士的寧誘發(fā)的3種小鼠驚厥模型均有不同程度的對(duì)抗作用;李冬冬等以全蝎粗提液灌胃,利用大鼠紅藻氨酸(KA)癲癇模型,證明全蝎具有明顯降低海馬神經(jīng)元興奮性及抗癲癇發(fā)作敏感性形成的作用。本室前期研究業(yè)已表明,全蝎的乙醇提取物可以明顯對(duì)抗MES和戊四唑驚厥,能使皮層定位注射青霉素誘發(fā)大鼠海馬癇性放電的潛伏期顯著延長、顯著降低癇波最高波幅;同時(shí)在達(dá)峰期可使大鼠的驚厥發(fā)作程度降低,明顯對(duì)抗大鼠青霉素點(diǎn)燃效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),灌胃2種劑量全蝎醇提物,均使耐藥大鼠驚厥閾值升高,對(duì)耐苯妥英鈉驚厥大鼠驚厥發(fā)作有對(duì)抗作用。Tishler等于1995年首先報(bào)道了在RE患者手術(shù)切除的癲瘌灶內(nèi)有mdr1mRNA的過度表達(dá),而且免疫組化研究亦發(fā)現(xiàn)P-gp在毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)。而且在mdr表達(dá)陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中,其細(xì)胞內(nèi)苯妥英鈉的濃度僅為mdr陰性細(xì)胞的25%,因此認(rèn)為P-gp通過限制抗癲痢藥物進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),導(dǎo)致RE的產(chǎn)生。全蝎醇提物和維拉帕米均可有效抑制耐苯妥英鈉驚厥大鼠腦內(nèi)mdr1mRNA表達(dá),同時(shí)可明顯降低耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)耐藥蛋白P-gp的含量。提示全蝎的乙醇提取物通過抑制P-gp的過量表達(dá),解除大鼠對(duì)苯妥英鈉的耐藥現(xiàn)象,使苯妥英鈉再次發(fā)揮抗癲癇作用。說明其抗耐藥機(jī)制與抑制耐藥驚厥大鼠腦內(nèi)mdr1mRNA表達(dá)和減少其表達(dá)產(chǎn)物P-gp有關(guān)。由于全蝎乙醇提取物和維拉帕米組大鼠腦內(nèi)P-gp表達(dá)變化趨勢(shì)