免疫組化和熒光課件

制白慧大家好！2021-3-211免疫組化圖片

2021-3-212免疫熒光圖片

2021-3-213免疫組化與免疫熒光免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反響使標記的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素等)顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法；這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。2021-3-214實驗原理免疫學的根本反響是抗原-抗體反響。由于抗原抗體反響具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反響時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反響使標記的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原；免疫熒光技術是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體〔或抗原〕上，與其相應的抗原〔或抗體〕結合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反響。2021-3-215實驗步驟脫蠟水化：二甲苯Ⅰ20min二甲苯Ⅱ20min無水乙醇Ⅰ10min無水乙醇Ⅱ10min95%乙醇5min80%乙醇5min75%乙醇5min50%乙醇過一遍蒸餾水過三遍高壓修復4min流水冷卻PBS沖洗5min×3次3%H2O215min，37℃/(0.5%Triton5min)PBS沖洗5min×3次10%山羊血清封閉37℃，50min一抗4℃,過夜復溫37℃，1h

PBS沖洗5minx3次

二抗30min

PBS沖洗5minx3次

DAB顯色＜1min/(DAPI5min)

PBS沖洗(蓋片，觀察。)蘇木素復染1min自來水沖洗脫水，透明，封片。2021-3-216石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1〕烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；

2〕用含有多聚賴氨酸的玻片；

3〕有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

4〕用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。2021-3-219免疫組化常見問題的處理

標本無染色①確認是否忽略了應該加的某種試劑(一抗、二抗、三抗及底物等)。②確認所有的試劑是否按正確的順序參加，是否孵育了足夠的時間。③對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配。④檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。⑤檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應防止反復凍融，試劑保存時一定要防止與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。⑥檢查標本的儲存條件，最好用陽性的標本來同時做陽性對照。⑦檢查沖洗液是否和反響試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。⑧檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。2021-3-2110弱陽性

①標本的固定方式，不當?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質量。②不適當?shù)目乖迯头绞?，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。③抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最正確的使用濃度。④切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。⑤孵育時切片是否放置水平，否那么會導致抗體流失。如果陰性對照沒有反響，陽性對照反響良好，而標本弱陽性，那么可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。2021-3-2111產生組織切片非特異性染色

1〕抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。2〕一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，可試用單克隆抗體；

3〕內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高〔含血細胞多的組織〕，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4〕非特異性組分與抗體結合，通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

5〕DAB孵育時間過長或濃度過高；

6〕PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗孵育之后的浸洗要充分；

7〕標本染色過程中經常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。2021-3-2112免疫熒光常見問題的處理非特異性染色產生原因及其解決方案：⑴游離熒光素殘留在二抗中。購置高質量、高純度的熒光素二抗。⑵抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。⑶組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原，可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。延長血清封閉時間。⑷從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。⑸抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。⑹熒光素不純、標本固定不當?shù)?。⑺一抗和二抗孵育條件和濃度不適宜。調整一抗和二抗孵育條件和濃度至最正確。⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長清洗時間。2021-3-2113陰性染色產生的原因有⑴一抗和二抗?jié)舛炔贿m宜或孵育條件不妥。⑵熒光素提前衰退。熒光素質量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項。⑶血清