中國(guó)東亞鉗蝎毒中多肽的分離與鑒定

中國(guó)東亞鉗蝎毒中多肽的分離與鑒定

1抗癲癇肽的藥物成分蝎子是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥，其有效藥物成分是蝎子。迄今為止,從蝎毒中可鑒定出的活性多肽和酶多達(dá)幾十種,但在醫(yī)藥上真正具有確切療效的多肽僅限于抗癲癇肽(anti-epilepsypeptide,AEP)、鎮(zhèn)痛肽(scorpionanalgesicpeptide,SAP)和抗腫瘤肽(anti-neoplasticpeptide,ANP)等幾種成分。蝎毒抗癲癇肽對(duì)癲癇具有很強(qiáng)的抑制作用且不易使人產(chǎn)生依賴性,是一種理想的抗癲癇藥物;蝎毒鎮(zhèn)痛肽不僅具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用,而且不會(huì)象嗎啡和杜冷丁類藥物那樣容易使人產(chǎn)生成癮性;而蝎毒抗腫瘤肽不僅能高選擇性地殺傷人肝癌細(xì)胞株等多種腫瘤細(xì)胞,而且能夠提高正常組織的免疫活性,增強(qiáng)機(jī)體抗放化療的輻射能力。Zhou等首次用三步色譜法在蝎毒中分離得到了抗癲癇肽并測(cè)定了其N端50個(gè)氨基酸序列;王起振等采用離子交換色譜和凝膠排阻色譜從粗毒中分離出鎮(zhèn)痛肽;韓雪飛等采用一步CMSephadexC-50超長(zhǎng)柱從粗毒中純化了鎮(zhèn)痛肽;孔天翰等分別用低壓陽(yáng)離子交換柱和低壓排阻柱及離子交換柱從東亞鉗蝎中分離和提取了抗腫瘤肽。本實(shí)驗(yàn)通過高壓陽(yáng)離子交換和凝膠排阻色譜柱,提供了一種快速的能夠同時(shí)對(duì)全蝎毒中的抗癲癇肽、鎮(zhèn)痛肽和抗腫瘤肽進(jìn)行分離和鑒定的方法,并且在高壓色譜柱提供的分離信息的基礎(chǔ)上,在軟膠上通過低壓色譜柱對(duì)這3種多肽進(jìn)行了較大量的分離和鑒定。2實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑中國(guó)東亞鉗蝎(ButhusmartensiiKarsch,BMK)蝎毒用電刺激法提取,冷藏于冰箱。高壓陽(yáng)離子柱和排阻柱分別為Shim-PackWCX-1羧甲基柱(?4mm×5cm)和Shim-PackDIOL-300預(yù)裝柱(?7.9mm×25cm),低壓色譜用Pharmacia公司的CMSepharoseCL-6B羧甲基介質(zhì)裝柱(?1.3cm×134.5cm)。所用化學(xué)試劑均為分析純。高效色譜用島津公司的LC-10A型高壓液相色譜儀,常壓色譜用BIO-RAD公司的Bio-logicLP型低壓色譜儀。2.2高效離子交換色譜高壓離子交換色譜流動(dòng)相A液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4),B液為含0.5mol/LNaCl的A液。洗脫梯度程序?yàn)?0~5min,100%A液;5~40min,B液從0線性變化到100%。流動(dòng)相流速0.5mL/min。樣品為蝎毒原液40μL與60μLA液混合,12,000r/min離心5min,取上清液上樣。280nm紫外檢測(cè)。高壓凝膠排阻色譜流動(dòng)相為含0.2mol/LNaCl的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。樣品為蝎毒原液經(jīng)高壓離子交換柱分離后的含抗癲癇肽、鎮(zhèn)痛肽和抗腫瘤肽的收集峰,進(jìn)樣50μL。280nm紫外檢測(cè)。低壓離子交換色譜流動(dòng)相與高壓離子交換色譜相同。先用A液洗脫約一個(gè)柱體積,再用A液與B液的線性梯度洗脫約6個(gè)柱體積。上樣和洗脫流速分別為0.2mL/min和0.3mL/min。樣品為1.8mL蝎毒原液溶于4.5mLA液中,離心后取上清液上樣。280nm紫外檢測(cè)。2.3對(duì)小鼠的毒活性和藥物活性的測(cè)定抗癲癇肽活性用馬桑內(nèi)酯(coriarialactone)誘發(fā)的驚厥SD大鼠模型測(cè)定;鎮(zhèn)痛肽活性用小鼠醋酸扭體法測(cè)定;蝎毒抗腫瘤多肽活性用MTT法測(cè)定。在各方法中,每個(gè)樣品用同法測(cè)定3次,取其平均值。3結(jié)果與討論3.1柱上洗脫強(qiáng)度檢測(cè)首先用一般常用的0~30minB液從0線性變化到100%,30~40minB液維持100%的洗脫方式對(duì)全蝎毒進(jìn)行了分離。采用這種洗脫方式所得到的分離圖譜在溶劑峰處只能檢測(cè)到一個(gè)峰,在大約30min后也僅能看到一個(gè)明顯的色譜峰。為了能夠使蝎毒得到更好的分離,在降低B液洗脫強(qiáng)度(B液中NaCl濃度從0.8mol/L降到0.5mol/L)的同時(shí)采用了圖1的洗脫方式。在圖1中,全蝎毒在柱上的分離峰可以大概從時(shí)間上劃分為3組:0~5min最先流出的一組峰,20~30min流出的中間一組峰,31~39min流出的最后一組峰。由于后面洗脫方式鹽的濃度變化比較緩慢,洗脫強(qiáng)度變化比較緩和,因此,使原來只能檢測(cè)到的一個(gè)溶劑峰,在此處被分離成至少3個(gè)峰;使原來在30min后只能檢測(cè)到的一個(gè)峰,在此處也被分離成至少5個(gè)峰。結(jié)合文獻(xiàn)可知,蝎毒中的抗癲癇肽、鎮(zhèn)痛肽和抗腫瘤肽活性成分可能分別位于上述3組峰中的某一峰中。3.2不同的單次注射峰及用藥時(shí)間分別收集圖1中0~5min之間的3個(gè)主要色譜蜂(第一組峰,編號(hào)1~3),20~30min之間的6個(gè)主要色譜蜂(第二組峰,編號(hào)從4~9),30~40min之間的5個(gè)主要色譜蜂(第三組峰,編號(hào)10~14),分別測(cè)定它們的抗癲癇活性、鎮(zhèn)痛活性和抗腫瘤活性,測(cè)定結(jié)果分別見表1、表2和表3。表1表明,在第一組峰中,僅峰3能夠顯著延長(zhǎng)用馬桑內(nèi)酯誘發(fā)的驚厥SD大鼠的癲癇發(fā)作時(shí)間。因此,峰3(保留時(shí)間約3.5min)中應(yīng)當(dāng)含有蝎毒抗癲癇肽。而其中峰1和峰2的癲癇發(fā)作時(shí)間比兩個(gè)生理鹽水對(duì)照組時(shí)間稍長(zhǎng),可能是實(shí)驗(yàn)誤差造成的;在表2中,注射峰6(保留時(shí)間約24min)后的小鼠的扭體次數(shù)顯著小于注射其它峰后小鼠的扭體次數(shù),因此可以確定其中含有蝎毒鎮(zhèn)痛肽。由于安痛定B濃度小于安痛定A,小鼠的平均扭體次數(shù)也更大一些;而在表3中的5個(gè)接收峰中,峰13(保留時(shí)間約36min)的吸光度值明顯小于其它色譜峰,表明它具有抗腫瘤活性,應(yīng)當(dāng)含有蝎毒抗腫瘤肽。3.3小鼠抗癲癇活性測(cè)定粗蝎毒經(jīng)Shim-packWCX-1柱分離后,分別取含抗癲癇肽、鎮(zhèn)痛肽和抗腫瘤肽的收集液各50μL,在DIOL-300高壓排阻柱上進(jìn)一步分離。含抗癲癇肽收集液在其上約13和18min被分離成兩個(gè)峰,活性測(cè)定表明,約18min處的峰具有抗癲癇活性,其在Shim-packVP-ODS反相色譜柱上的純度約98%;含鎮(zhèn)痛肽收集液在其上約19和23min也被分離成兩個(gè)峰,小鼠醋酸扭體法活性測(cè)定和Shim-packVP-ODS純度測(cè)定,約23min處的色譜峰具有鎮(zhèn)痛活性,純度約97%;含抗腫瘤肽收集液在其上約5、17、20和23min被分離成4個(gè)峰,MTT法活性測(cè)定和Shim-packVP-ODS純度測(cè)定,約23min處的色譜峰具有抗腫瘤活性,純度約95%。3.4抗癲癇肽的分離圖譜在高壓離子交換柱提供的全蝎毒分離信息的基礎(chǔ)上,在低壓色譜上用具有較大吸附容量的與高壓柱具有相同交換基團(tuán)的CMSepharoseCL-6B介質(zhì)對(duì)較大量的蝎毒在相似條件下進(jìn)行了分離和鑒定,全蝎毒在CMSepharoseCL-6B柱上的分離圖譜見圖2。由于CMSepharoseCL-6B是軟膠且柱本身較長(zhǎng),不可能采用較大的流速,而流速太低,分離過程的擴(kuò)散效應(yīng)較大,因此,這里用了0.3mL/min的流速。為了在不太長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)使全蝎毒得到較好分離,采用了與高壓色譜洗脫程序相比平臺(tái)和線性梯度洗脫階段洗脫柱體積都較少的洗脫程序。全蝎毒在高壓柱和低壓柱上的分離圖譜之間存在著很多相似性。在圖2中全蝎毒的分離峰也可分為3組:0~600min處的一組峰,1200~2700min處的中間一組峰,3000~4500min處的最后一組峰。在A液的等度洗脫階段,抗癲癇肽在兩個(gè)柱子上都能得到較好的分離且都位于第一組峰的最后一峰中;在梯