米氏常數(shù) 米氏常數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的報(bào)告

米氏常數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的報(bào)告研究酶的科研汪們都知道，無(wú)論是表達(dá)一種新酶，還是工程一個(gè)現(xiàn)有的酶，都需要對(duì)酶的一系列特性進(jìn)行表征。在表征酶功能的眾多性質(zhì)中Km和Kcat是兩個(gè)非常重要的參數(shù)，了解Km和Kcat的意義。小編這次主要介紹Km以及Vmax的測(cè)定方法（喂！你上面不是說(shuō)Kcat嗎，這里咋冒出了Vmax？請(qǐng)點(diǎn)上面鏈接復(fù)習(xí)Kcat和Vmax之間的關(guān)系）。為了方便后文的介紹，有必要在這里出現(xiàn)一下米氏方程（Michaelis-MentenEquation）：公式中V是酶促反應(yīng)速率，[S]是底物濃度，Vmax是最大反應(yīng)速率，Km為米氏常數(shù)。米氏方程可是小編母校研究生面試必考題目，不能忘記!Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法：自然界中酶有千萬(wàn)種，但并非所有的酶都遵循米氏方程，為了驗(yàn)證酶是否遵循米氏方程，我們可以實(shí)驗(yàn)測(cè)定在同一酶濃度條件下，不同的底物濃度對(duì)應(yīng)的酶初始反應(yīng)速率。然后畫出Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，也就是米氏方程的倒數(shù)改寫：對(duì)于遵循米氏方程的酶促反應(yīng)，1/V與1/[S]之間應(yīng)該為線性關(guān)系，如下圖。從上圖中我們可以很容易的計(jì)算出Vmax和Km:Vmax是線性方程縱截距的倒數(shù)，Km是線性方程橫截距倒數(shù)的相反數(shù)。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法通常能夠比較準(zhǔn)確的測(cè)定出Km與Vmax，但是雙倒數(shù)的方法有一個(gè)問(wèn)題，就是低濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)占據(jù)了過(guò)高的權(quán)重。在底物濃度很低時(shí)，產(chǎn)物生成的速度也很低，因此測(cè)定反應(yīng)速度的精度就很低。如果上面的論述不是很清楚，下面這張圖應(yīng)該可以更好說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題：

從上圖可以看到最小底物濃度時(shí)酶促反應(yīng)速率很低，所以在1/[S]很大時(shí)1/V的數(shù)值也很大，這導(dǎo)致低濃度的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)占據(jù)了過(guò)大的權(quán)重，實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)點(diǎn)無(wú)法均勻的分布在圖中。為了克服這一缺點(diǎn)，Eadie-Hofstee做圖法以及Hanes做圖法相繼被提出。值得一提的是，盡管雙倒數(shù)法有這一缺陷，其仍然是學(xué)術(shù)界最普遍應(yīng)用的測(cè)定米氏常數(shù)的方法[1]。Eadie-Hofstee做圖法[2]：這種方法將米氏方程以如下形式改寫：v=Vmax-Kmxv/[S]以反應(yīng)速率V對(duì)V/[S]進(jìn)行做圖，會(huì)得到如下圖中的直線：從圖中可以發(fā)現(xiàn)Vmax是線性方程的縱截距，而直線的斜率就是Km的相反數(shù)。Eadie-Hofstee方法克服了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)分布不均的問(wèn)題，然而這種方法也有一個(gè)問(wèn)題，就是V被用了兩次，既出現(xiàn)在橫坐標(biāo)也出現(xiàn)在了縱坐標(biāo)，因此在測(cè)量反應(yīng)速率時(shí)出現(xiàn)的誤差會(huì)被疊加，這會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)Km與Vmax的準(zhǔn)確度降低。Hanes做圖法：Hanes做圖法以如下形式重排米氏方程：[S]/v=Km/Vmax+[S]/Vmax以[S]/v對(duì)[S]做圖會(huì)得到下面的直線:

從圖中可知Y截距是Km/Vmax，直線斜率是1/Vmax，X截距是Km的相反數(shù)。這種方法同樣克服了實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)點(diǎn)分布不均以及低濃度點(diǎn)過(guò)高權(quán)重的問(wèn)題，但是從圖中可以發(fā)現(xiàn)[S]被使用了兩次，橫縱坐標(biāo)中都有底物濃度的參與。與Eadie-Hofstee做圖法類似，這會(huì)導(dǎo)致底物濃度測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的誤差被疊加。底物濃度測(cè)定產(chǎn)生的誤差主要來(lái)自于微量移液器的使用（計(jì)算錯(cuò)誤這種問(wèn)題就不討論了?。。虼顺悄阌袠O高的移液器使用技巧，否則不推薦使用本方法。非線性擬合：通過(guò)對(duì)上面方法的了解，似乎倒數(shù)法中的每種方法都有弊端。那我們不妨回歸到開始，米氏方程是這樣的:我們?yōu)槭裁床荒苤苯訉與[S]進(jìn)行非線性擬合到米氏方程，從而直接獲得Vmax以及Km呢？事實(shí)上，這種非線性擬合的方法相對(duì)于倒數(shù)法更準(zhǔn)確。非線性回歸是在對(duì)變量的非線性關(guān)系有一定認(rèn)識(shí)前提下，對(duì)非線性函數(shù)的參數(shù)進(jìn)行最優(yōu)化的過(guò)程，最優(yōu)化后的參數(shù)會(huì)使得模型的殘差平方和達(dá)到最小。非線性擬合相對(duì)于雙倒數(shù)法的麻煩之處在于測(cè)量酶的反應(yīng)速率時(shí)底物濃度的選擇要盡量多，并且要覆蓋米氏方程曲線的三個(gè)區(qū)域：一級(jí)反應(yīng)區(qū)，反應(yīng)速率隨底物濃度增加而直線增加；混合級(jí)反應(yīng)區(qū)域，趨于平緩；最后是零級(jí)反應(yīng)區(qū)域，反應(yīng)速率不再隨底物濃度增加而增加。只有選擇的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)完整的覆蓋這些區(qū)域，擬合出來(lái)的米氏方程才是準(zhǔn)確的。用于非線性回歸分析的軟件很多，比如Sigmaplot，Matlab，Orgin等等。下面我們以O(shè)rginPro9.0為例，看一下如何利用Origin做圖軟件擬合米氏方程并獲得方程中的兩個(gè)常數(shù)Vmax以及Km。1.首先新建一個(gè)數(shù)據(jù)表，將底物濃度與反應(yīng)速率的數(shù)據(jù)輸入，設(shè)定底物濃度為橫坐標(biāo)X，反應(yīng)速率的縱坐標(biāo)Y2.全選X與Y坐標(biāo)數(shù)據(jù)，然后選擇菜單欄Analysis:Fitting:NonlinearCurveFit：OpenDialog3.在Setting：FunctionSelection頁(yè)面內(nèi)的Category選擇Pharmacology,Function選擇米氏方程（MichaelisMenten）,而后點(diǎn)擊Fit便可得到擬合結(jié)果了。注意：Origin8.0以前的版本中沒有保存米氏函數(shù)，大家可以選擇Hill函數(shù)。Hill函數(shù)如下：當(dāng)Hill函數(shù)中的n等于1時(shí)，該函數(shù)就變成了米氏方程。4.非線性擬合結(jié)束后即可查看擬合結(jié)果報(bào)告，從Summary一欄中我們可以知道通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得到的最大反應(yīng)速率Vmax是4.51mM/min，米氏常數(shù)Km是23.26mM。結(jié)果報(bào)告中同時(shí)給出了計(jì)算所得數(shù)據(jù)的誤差（standarderror），比如Vmax的誤差0.40884。我們也可以在報(bào)告中查看擬合結(jié)果的準(zhǔn)確性,衡量擬合效果最常用的指標(biāo)是R2，本次擬合的Rsquare等于0.95757。另外我們也可以在擬合報(bào)告中查看擬合獲得的圖形（見下圖）?？偨Y(jié)：Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法是常用的測(cè)定酶米氏常數(shù)Km的方式，然而由于其低濃度數(shù)值引起的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分布不均的問(wèn)題常導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。Hanes做圖法以及Eadie-Hofstee做圖法克服數(shù)據(jù)點(diǎn)分布不均的問(wèn)題，但兩種方法的準(zhǔn)確性受實(shí)驗(yàn)操作誤差影響極大。倒數(shù)法的另一個(gè)問(wèn)題就是無(wú)法處理0以及負(fù)數(shù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。在測(cè)定反應(yīng)速率時(shí)我們有時(shí)需要減去空白對(duì)照，這時(shí)所得的數(shù)偶爾是0或者負(fù)數(shù)。但是在倒數(shù)法中V和[S]處在分母的位置，這些數(shù)據(jù)點(diǎn)是無(wú)法用倒數(shù)法處理的。非線性擬合是一種相對(duì)準(zhǔn)確的測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)的方法，同時(shí)能夠處理0或負(fù)數(shù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)，但是需要檢測(cè)足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)以便覆蓋曲線的全部區(qū)域。有文獻(xiàn)報(bào)道,為了計(jì)算得到相對(duì)準(zhǔn)確的Km值，需要至少10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)[3]。參考文獻(xiàn):[1]Markus,M,Hess,B,Ottway,JHandCornish-Bowden,A(1976)FEBSLetters63,225-230[2]Hofstee,BHJ(1959)Nature184,1296-1298[3]RitchieR