抗體技術(shù)課件

Antibody

IgG

structure1第1頁(yè)/共69頁(yè)Antibody

IgG

structure2第2頁(yè)/共69頁(yè)VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2MembraneExtensionAntibody

IgG

structure4第4頁(yè)/共69頁(yè)Fab抗原結(jié)合片段Fc恒定區(qū)片段VLCLVHCH15第5頁(yè)/共69頁(yè)CH2CH3Antibody

IgG

structure抗體可變區(qū)片段VH6第6頁(yè)/共69頁(yè)VLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingle

Chain

Fragment

variable7第7頁(yè)/共69頁(yè)抗體——生物體最奇妙的分子8第8頁(yè)/共69頁(yè)無(wú)限的多樣性（diversity)功能與結(jié)構(gòu)的雙重性可變區(qū)——抗原結(jié)合恒定區(qū)——生物學(xué)效應(yīng)功能分泌型和膜型表達(dá)與抗體有關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者9第9頁(yè)/共69頁(yè)1901von

Bering血清治療1908Ehrlich

&Metchnikoff抗體生成、吞噬1972Edelman

&

Poter抗體分子結(jié)構(gòu)1977Yalow放射免疫測(cè)定1984Koler,Milstein&

Jerne單克隆抗體1987TonegawaIg基因結(jié)構(gòu)本節(jié)課主要內(nèi)容10第10頁(yè)/共69頁(yè)一、細(xì)胞工程抗體和基因工程抗體二、治療性單抗研制進(jìn)展一、細(xì)胞工程抗體和基因工程抗體11第11頁(yè)/共69頁(yè)抗體研究領(lǐng)域的進(jìn)展大致可分為三階段：以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉毒素免疫血清（白喉抗毒素）為代表，其特點(diǎn)是用抗原免疫動(dòng)物來(lái)獲得多克隆抗體;以1975年Kohler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表;以1994年Winter用基因工程方法制備抗體為代表;（一）多克隆抗體(Polyclonal

antibody)1.

概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體.第12頁(yè)/共69頁(yè)122.多克隆抗體的應(yīng)用第13頁(yè)/共69頁(yè)免疫學(xué)檢測(cè)被動(dòng)免疫治療和緊急預(yù)防存在問(wèn)題

特異性差,

用于免疫學(xué)檢測(cè)容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)13（二）單克隆抗體(Monoclonal

antibody,McAb)14第14頁(yè)/共69頁(yè)通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.單克隆抗體的特性15第15頁(yè)/共69頁(yè)高度均一性：純度很高的均一性抗體高度專一性：只對(duì)抗原分子上某一抗原決定簇起反應(yīng)大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性：雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無(wú)限繁殖之傳代１、細(xì)胞工程抗體——雜交瘤-單克隆抗體16第16頁(yè)/共69頁(yè)17第17頁(yè)/共69頁(yè)18第18頁(yè)/共69頁(yè)19第19頁(yè)/共69頁(yè)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的主要步驟包括20第20頁(yè)/共69頁(yè)抗原制備；

免疫動(dòng)物；

免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；

細(xì)胞融合；

雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；

雜交瘤細(xì)胞的篩選；

雜交瘤細(xì)胞的克隆化；

單克隆抗體的檢定；

分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；

單克隆抗體的大量制備。免疫動(dòng)物21第21頁(yè)/共69頁(yè)免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的過(guò)程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，

抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)22第22頁(yè)/共69頁(yè)細(xì)胞融合的基本方法：取適量脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，在PEG作用下融合，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋,將混合體系移入選擇性培養(yǎng)基HAT中培養(yǎng)。HAT選擇性培養(yǎng)的原理23第23頁(yè)/共69頁(yè)融合后產(chǎn)生脾脾、脾瘤、瘤瘤融合細(xì)胞和未融合的骨髓瘤細(xì)胞。次黃嘌呤（

H

）、氨基碟呤（

A

）和胸腺嘧啶（

T

）氨基碟呤（

A

）阻斷嘌呤和嘧啶的合成HAT選擇性培養(yǎng)的原理24第24頁(yè)/共69頁(yè)骨髓瘤細(xì)胞選用次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（

HGPRT）缺陷型,不能利用外源性次黃嘌呤來(lái)合成自身核酸中所需要的嘌呤，而內(nèi)源性嘌呤和嘧啶的合成又被氨基碟呤所阻斷，不能在HAT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。B淋巴細(xì)胞無(wú)法在體外繁殖傳代。脾細(xì)胞內(nèi)有這種轉(zhuǎn)移酶，故脾瘤雜交細(xì)胞能用H和T合成DNA而得以生長(zhǎng)。在最適培養(yǎng)條件下，大約105

個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，

通常加入飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞）飼養(yǎng)細(xì)胞釋放某些生長(zhǎng)刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，應(yīng)用較多。25第25頁(yè)/共69頁(yè)篩選陽(yáng)性克隆與克隆化26第26頁(yè)/共69頁(yè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右，所以融合后8-9天對(duì)每孔的培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體活性的篩選工作，

篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆。常用方法：酶聯(lián)免疫吸附法，免疫熒光技術(shù)（適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè)）和放射免疫技術(shù)。盡早克隆化。雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定27第27頁(yè)/共69頁(yè)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析對(duì)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行Ig類和亞類的鑒定對(duì)單克隆抗體特異性、純度和識(shí)別抗原的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。單克隆抗體的大量制備28第28頁(yè)/共69頁(yè)體外培養(yǎng)法在培養(yǎng)液中添加10%-20%小牛血清，由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá)100mg/ml,純化困難。小牛血清又是支原體污染的原因。無(wú)血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。但產(chǎn)量不高。用懸浮培養(yǎng)方式代替靜止培養(yǎng)法，微載體懸浮培養(yǎng)多采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法雜交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞都來(lái)自BALB/c小鼠，故選用BALB/c小鼠制備單克隆抗體。先給小鼠注射刺激性的有機(jī)溶劑降植烷（破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤

細(xì)胞易于增殖的環(huán)境），然后注射雜交瘤細(xì)胞，待生成腹水后再抽取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價(jià)高，可有效保存雜交瘤細(xì)胞株。缺點(diǎn)是小鼠腹水中混有來(lái)自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來(lái)難度。29第29頁(yè)/共69頁(yè)單克隆抗體的純化30第30頁(yè)/共69頁(yè)在純化之前必須明確其Ig類和亞類，Ig類和亞類不同，純化方法也不同；根據(jù)用途不同選擇不同的純化方法；如用于體外診斷試劑的IgG類抗體應(yīng)采用沉淀處理結(jié)合親和層析親和層析的方法。IgM類抗體應(yīng)采用沉淀處理結(jié)合凝膠過(guò)濾的方法；體內(nèi)診斷試劑或治療用藥物應(yīng)去除內(nèi)毒素、病毒、核酸等微量污染物，必須采用親和層析和陰離子交換層析。動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備的單克隆抗體的純化方法：

澄清和沉淀處理分離凝膠過(guò)濾陰離子交換層析親和層析31第31頁(yè)/共69頁(yè)２、單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用32第32頁(yè)/共69頁(yè)A、用作診斷試劑

檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不同分化階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。用于腫瘤的診斷和分型激素類單抗用于測(cè)定體內(nèi)激素含量，判 斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)B、用作研究工具33第33頁(yè)/共69頁(yè)純化抗原分析和探查抗原結(jié)構(gòu)分析抗原決定簇分子的功能C、用于疾病的治療抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療單克隆抗體用于免疫治療存在的問(wèn)題1)單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對(duì)腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對(duì)正常組織有交叉反應(yīng)2）異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗第用34頁(yè)于/共6人9頁(yè)

體，導(dǎo)致異34（三）基因工程抗體(Genetic

engineering

antibody)35第35頁(yè)/共69頁(yè)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、小分子抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。小分子抗體36第36頁(yè)/共69頁(yè)鼠單抗人源化基因工程改造的抗體小分子抗體37第37頁(yè)/共69頁(yè)小分子抗體38第38頁(yè)/共69頁(yè)基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性McAb的V區(qū)（CDR）片段，其相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為原抗體的1/80-1/3。Fab

片段抗體，由完整的輕鏈和重鏈(VH

+CH1

）組成Fv

抗體（

VH

+VL，非共價(jià)結(jié)合）單鏈抗體:由VH

和VL

通過(guò)一段連接肽（

Linker）連接而成的重組蛋白單域抗體：由VH

或VL

單個(gè)可變區(qū)抗體融合蛋白抗原結(jié)合部位與生物活性蛋白結(jié)合 免疫導(dǎo)向免疫橋連嵌合受體39第39頁(yè)/共69頁(yè)抗體融合蛋白40第40頁(yè)/共69頁(yè)酶-抗體型偶合蛋白（抗體酶）在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物。當(dāng)抗體和酶的融合蛋白定位在腫瘤部位后再給予前體藥物，藥物經(jīng)酶催化顯示活性，提高腫瘤區(qū)域的藥物濃度，降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性。構(gòu)建抗體融合蛋白的基本原則：將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因共表達(dá)。在構(gòu)建過(guò)程中關(guān)鍵的問(wèn)題是兩個(gè)蛋白間的Linker序列，一般3-5個(gè)氨基酸可滿足大部分融合蛋白的正確折疊要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的肽鏈，可緩解兩種蛋白的相互干擾。在真核細(xì)胞中表達(dá)一般不涉及復(fù)性問(wèn)題，其優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⒖贵w多肽正確折疊和糖基化，省去了繁雜的體外復(fù)性，缺點(diǎn)是產(chǎn)量低。在原核細(xì)胞中表達(dá)有兩種形式：一種分泌至菌體外，成為有活性的可溶性融合蛋白；另一種以胞內(nèi)包涵體形式存在，需溶解包涵體重新折疊，成為有活性的蛋白質(zhì)。41第41頁(yè)/共69頁(yè)嵌合抗體42第42頁(yè)/共69頁(yè)從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。保留鼠源性Mc

Ab的CDR區(qū)的結(jié)構(gòu)，抗體活性不會(huì)消失（

CDR區(qū)以外的其它部分不影響抗體活性），將C區(qū)用人的Ig分子的C區(qū)置換，則對(duì)人的免疫原性消失。嵌合抗體43第43頁(yè)/共69頁(yè)嵌合抗體是構(gòu)建的第一個(gè)基因工程抗體，構(gòu)建時(shí)可對(duì)抗體亞類進(jìn)行變換，增強(qiáng)抗體的免疫治療效果。其半衰期約為鼠源的6倍，介導(dǎo)細(xì)胞毒性所需的抗體濃度也低于原McAb。20世紀(jì)末期構(gòu)建了為數(shù)眾多的抗各種惡性腫瘤的嵌合抗體，但真正應(yīng)用于臨床的較少，主要是因?yàn)樵摷夹g(shù)已被日益成熟的人源化抗體技術(shù)所取代。人源化抗體（humanized

antibody)44第44頁(yè)/共69頁(yè)運(yùn)用基因工程的方法將鼠McAb除重鏈、輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)（

CDR）以外的基因全部置換成人抗體的基因。又稱CDR移植抗體最大限度地降低了鼠McAb的免疫原性,在人體內(nèi)的生物半衰期基本上與人抗體類似。至今已有近百種人源化抗體申請(qǐng)臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的有30多種，有些已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)并獲政府批準(zhǔn)上市銷售。鼠單抗人源化45第45頁(yè)/共69頁(yè)恒定區(qū)人源化——人-鼠嵌合抗體可變區(qū)人源化——人改型抗體用抗體庫(kù)技術(shù)進(jìn)行人源化鼠單抗人源化46第46頁(yè)/共69頁(yè)雙價(jià)抗體與雙特異性抗體(bispecific47第47頁(yè)/共69頁(yè)許多抗原抗a體反n應(yīng)t要ib求雙o價(jià)d的y抗)原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。

將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。構(gòu)建方法48第48頁(yè)/共69頁(yè)化學(xué)交聯(lián)法

用化學(xué)試劑隨機(jī)交聯(lián)兩個(gè)Ig分子表面上的巰基，構(gòu)建雙功能抗體。化學(xué)交聯(lián)可能破壞抗體的功能，不易到達(dá)靶向部位，體內(nèi)穩(wěn)定性差，每次應(yīng)用都須重新構(gòu)建生物學(xué)方法

將分泌目的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞與分泌另一種抗體的脾細(xì)胞融合，形成可分泌親代抗體和雜種抗體的雜種-

雜交瘤細(xì)胞。構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜，周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，純化技術(shù)復(fù)雜，基因組過(guò)大不穩(wěn)定。49第49頁(yè)/共69頁(yè)基因工程方法

1993年Holligen等構(gòu)建出小分子雙功能抗體（SCFV）2，是雙功能抗體研究領(lǐng)域的里程碑。用接頭連接不同抗體的VH和VL區(qū)，使它們不能形成鏈內(nèi)的分子配對(duì)，讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對(duì)構(gòu)建成雙特異性（SCFV）2。雙功能抗體一臂識(shí)別腫瘤細(xì)胞抗原（癌基因產(chǎn)物），另一臂識(shí)別免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子，介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞或毒素與藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用50第50頁(yè)/共69頁(yè)單鏈抗體51第51頁(yè)/共69頁(yè)單鏈抗體較好地保持了抗體親和力，相對(duì)分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性小，且易與效應(yīng)效應(yīng)分子相連接，構(gòu)建出多種新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。因此成為基因工程抗體研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。單鏈抗體基因構(gòu)建的一般方法：采用從雜交瘤細(xì)胞提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增抗體VH和VL基因，人工合成一條寡核苷酸序列（Linker序列），將VL與VH連接構(gòu)建單鏈抗體基因修飾抗體（modified

antibody)52第52頁(yè)/共69頁(yè)將放射性核素、生物毒素（白喉毒素、綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒蛋白、蛇毒蛋白、相思子蛋白）或毒性極強(qiáng)的合成藥物及抗生素等共價(jià)結(jié)合到抗體分子上.通過(guò)McAb可特異地將毒素導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞等的靶部位，以達(dá)到毒殺腫瘤細(xì)胞而少損傷正常細(xì)胞的功效，形象地稱之為生物導(dǎo)彈（藥物導(dǎo)彈、免疫毒素）。治療性單抗的研究進(jìn)展53第53頁(yè)/共69頁(yè)1.雜交瘤-單克隆抗體技術(shù)誕生54第54頁(yè)/共69頁(yè)抗獨(dú)特型治療淋巴瘤成功OKT3被批準(zhǔn)上市單抗用于腫瘤治療效果不佳抗內(nèi)毒素單抗試用于敗血性休克失敗抗17-1A和ReoPro上市FDA批準(zhǔn)6個(gè)單抗上市治療性抗體發(fā)展歷程和事件OKT355第55頁(yè)/共69頁(yè)OKT3是美國(guó)Ortho公司生產(chǎn)的OKT(OrthoKungTcellOKT)系列中的一種抗人T淋巴細(xì)胞分化抗原CD3的單克隆抗體，CD3抗原是成熟T細(xì)胞的共同分化抗原，在全部外周血T細(xì)胞和胸腺、淋巴結(jié)內(nèi)接近成熟的T細(xì)胞上表達(dá)。OKT3作為一種免疫抑制劑，主要用于預(yù)防和治療同種異體腎移植等器官移植后的急性排斥反應(yīng)。OKT3主要通過(guò)細(xì)胞清除、不育性激活、功能性受體封阻、免疫調(diào)變、刺激抑制細(xì)胞增殖以及直接作用于效應(yīng)細(xì)胞等途徑殺傷成熟T細(xì)胞或阻斷機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)達(dá)到抗排斥目的?？?7-1A：主要作用于結(jié)腸癌、直腸癌病人原發(fā)的和轉(zhuǎn)移的腫瘤；

Reopro是一類抗體類藥物，1994年首度獲得批準(zhǔn)，用于冠狀動(dòng)脈手術(shù)及心臟搭橋患者的治療，以防止其血液拴塞。56第56頁(yè)/共69頁(yè)抗體名稱抗體種類

靶向抗原

適應(yīng)癥批準(zhǔn)日期國(guó)）OKT3Panorex鼠單抗鼠單抗CD317-1A移植排斥

1986大腸癌

1995（德ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受體 冠心病 1994ⅡbⅢaRituxan人-鼠嵌合抗體CD20淋巴瘤1997Simulect人-鼠嵌合抗體CD25移植排斥1998Remicade

人-鼠嵌合抗體TNF-αZanapaxHerceptinSynagisMylotargCD25HER-2RSV

F蛋白

CD33炎癥性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎移植排斥乳腺癌

RSV感染淋巴瘤1998、19991997199819982000人源化抗體人源化抗體人源化抗體人源化抗體-化療藥物交連物Campath

人源化抗體CD52淋巴瘤2001已批準(zhǔn)上市的治療性單抗57第57頁(yè)/共69頁(yè)治療性單抗銷售概況58第58頁(yè)/共69頁(yè)國(guó)外有關(guān)抗體開(kāi)發(fā)的評(píng)述59第59頁(yè)/共69頁(yè)1998-2000年20%研制的生物藥品為單抗正在臨床試用的治療性單抗超過(guò)上百種預(yù)計(jì)到2008年7個(gè)主要市場(chǎng)用于腫瘤的治療性單抗的銷售額達(dá)44億美元10年后市場(chǎng)上的單抗將從現(xiàn)在的

11個(gè)→

100個(gè)以上，預(yù)計(jì)銷售額為$500億進(jìn)入臨床治療性單抗情況分析60第60頁(yè)/共69頁(yè)器官移植：11%感染：8%心血管：4%其它：6%所治療的疾病治療腫瘤：

32%治療免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病：37%