水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中的作用

水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中的作用

昆蟲誘導(dǎo)的植物蒸發(fā)在尋找食物性昆蟲天敵方面發(fā)揮著重要作用。近幾年來,通過對其釋放機(jī)理的研究表明,植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植食性昆蟲誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物釋放中發(fā)揮著中心作用。其中,有關(guān)茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用是目前在這方面研究得最多和最清楚的,這些結(jié)果表明很多植食性昆蟲誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物的釋放都涉及到茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用。水楊酸和H2O2是植物體內(nèi)普遍存在的兩類重要的與防御反應(yīng)相關(guān)的信號分子。已有的研究結(jié)果表明,水楊酸和H2O2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑除了在植物的誘導(dǎo)抗病反應(yīng)中起著重要作用外,在誘導(dǎo)的植物直接抗蟲反應(yīng)中亦發(fā)揮著重要作用。如水楊酸處理能提高柳樹Salixviminalis對Dasineuramarginemtorquens的抗性,降低該蟲的成活率。在玉米中過量表達(dá)大麥的glp基因會引起玉米中H2O2含量明顯上升,并最后導(dǎo)致對歐洲玉米螟的抗性增加。在煙草Nicotianaattenuata的研究中也發(fā)現(xiàn),glp基因與煙草體內(nèi)H2O2的產(chǎn)生有關(guān);當(dāng)反義抑制glp基因在煙草中的轉(zhuǎn)錄水平時(shí),會導(dǎo)致煙草H2O2及次生化合物含量下降,最后導(dǎo)致抗蟲性降低。而有關(guān)水楊酸以及H2O2等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在誘導(dǎo)的植物間接抗蟲反應(yīng)中的作用,即蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物釋放中的作用,則至今只有很少的研究報(bào)道。一則比較有意思的報(bào)道是有關(guān)水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在蟲害誘導(dǎo)的利馬豆揮發(fā)物釋放中的作用。Ozawa等研究發(fā)現(xiàn)二點(diǎn)葉螨為害所誘導(dǎo)的利馬豆揮發(fā)物主要由植物體內(nèi)的茉莉酸與水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所協(xié)同調(diào)控,而粘蟲Mythimnaseparata為害所誘導(dǎo)的揮發(fā)物則主要涉及到茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本文的研究目的是為了闡明水楊酸和H2O2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱Nilaparvatalugens(St?l)為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中的作用。先期的研究結(jié)果表明,褐飛虱為害可以系統(tǒng)性地誘導(dǎo)水稻揮發(fā)物的釋放,并且這些揮發(fā)物對褐飛虱卵期的重要寄生蜂稻虱纓小蜂AnagrusnilaparvataePangetWang具明顯的引誘作用。褐飛虱唾液中的蛋白質(zhì)類在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中起著重要作用,并且水稻體內(nèi)的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了水稻揮發(fā)物的釋放,而茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑則作用不明顯。為了闡明水楊酸和H2O2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物釋放中的可能作用,我們首先測定了褐飛虱取食后水稻體內(nèi)水楊酸和H2O2含量的變化,以明確褐飛虱為害是否能激活水稻體內(nèi)的水楊酸和H2O2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。然后,分析了外用水楊酸或H2O2處理后水稻揮發(fā)物的變化及其對稻虱纓小蜂的引誘作用,并同時(shí)與褐飛虱為害稻株進(jìn)行了比較。1材料和方法1.1紅色塑料盆缽內(nèi)tn水稻栽植水稻品種為感性品種TN1和汕優(yōu)63,在溫控培養(yǎng)箱催芽后,分期播種于溫室大棚內(nèi)。到秧齡10～20d時(shí),把TN1水稻移栽至紅色塑料盆缽(直徑15cm,高15cm)中,每盆10根。定期澆水施肥,待移栽后25～35d供試。汕優(yōu)63稻株用于供試?yán)ハx的種群繁殖。1.2黃褐色的飛虱蟲源來自于中國水稻研究所田間種群。然后在室外的網(wǎng)室內(nèi),利用汕優(yōu)63稻苗進(jìn)行種群繁殖,繁殖1～2代后的褐飛虱供試驗(yàn)用。1.3褐飛銻卵的繁殖帶褐飛虱卵的汕優(yōu)63水稻苗從浙江大學(xué)華家池校區(qū)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場中誘得,在(27±1)℃、12L∶12D的人工氣候室中,以TN1上的褐飛虱卵進(jìn)行繁殖。羽化的成蜂經(jīng)群體交配后,選用觸角齊全、大小基本一致、蜂齡在24h內(nèi)的雌蜂供試。1.4稻株對parafilm的把握取如上所述的盆栽水稻,用自來水小心沖洗干凈,并用剪刀去除小的分蘗,每盆留10根稻苗。3d后進(jìn)行下列3種處理:①H2O2處理。用解剖針在各稻株莖稈上下兩個(gè)部位各刺200次,然后分別在各損傷部位涂抹5,10,15,20或25μL的5%H2O2水溶液(相當(dāng)于在每稻株上處理H2O20.25、0.5、0.75、1.00或1.25mg)。以同樣的損傷方式,并處理以相同體積的蒸餾水,作為各相應(yīng)處理的對照。②水楊酸處理。各稻株的損傷處理同①,然后分別在各損傷部位涂抹5,10,15,20,25或30μL的10mmol·L-1水楊酸溶液(以50mmol·L-1的磷酸氫鈉緩沖液配制,緩沖液的pH值由1mol·L-1的檸檬酸滴定至8)(相當(dāng)于在每稻株上處理水楊酸6.91,13.81,20.72,27.62,34.53或41.44μg)。以同樣的損傷方式,并處理以相同體積的緩沖液,作為各相應(yīng)處理的對照。③褐飛虱為害處理。用parafilm膜做成約6cm×5cm的小袋,并在各小袋上用解剖針刺60個(gè)小孔。各小袋內(nèi)裝7頭或8頭懷卵的褐飛虱雌成蟲,分別固定在各稻株莖稈的上、下兩個(gè)部位,使每棵稻株上的接蟲量為15頭雌成蟲。在稻株莖稈上相同部位固定2個(gè)空的parafilm小袋,作為相應(yīng)的對照植物。水稻處理后,均放置在溫度(28±2)℃、光照12h、相對濕度80%的人工氣候室內(nèi)。一定時(shí)間后(具體見下面各實(shí)驗(yàn)的描述),處理稻株被用于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。1.5組織病理學(xué)ht將稻株隨機(jī)分成兩組處理:褐飛虱為害處理及其相應(yīng)的對照。分別在褐飛虱開始取食后0、0.5、1、1.5、3、4、8、12、24h,對為害部位或相應(yīng)的對照部位取樣。各部位取相應(yīng)的葉鞘組織0.2～0.35g,在液氮中迅速冷凍后,于-80℃下保存?zhèn)溆谩８魈幚砀鲿r(shí)間點(diǎn)重復(fù)5次。H2O2濃度的測定方法與LouandBaldwin(2006)所描述的相同。簡單而言,首先將樣品在液氮中磨成粉末,然后在各樣品中加入1mL的去離子水,充分混合后,在4℃、13600g條件下離心10min。取上清夜,然后按照試劑盒(Amplex?RedHydrogenPeroxide/PeroxidaseAssaykit)所描述的方法測定。1.6酸相色譜-質(zhì)譜條件將稻株隨機(jī)分成以下幾種處理:褐飛虱為害處理及其相應(yīng)的對照;H2O2處理及其相應(yīng)的對照。對于褐飛虱為害處理及其相應(yīng)的對照,其取樣時(shí)間同1.5。對于H2O2處理及其相應(yīng)的對照,其處理方法同1.4,所用的H2O2濃度為1.25mg·株-1,分別在處理后1.5和4h取樣。各處理在各時(shí)間點(diǎn)重復(fù)5次。水楊酸含量的分析方法參考Engelberth等。簡單而言,將樣品在液氮中充分磨碎后,在各樣品中加入1mL提取液[丙酮∶50mmol·L-1檸檬酸=7∶3(V/V)]和345ng2H6-SA內(nèi)標(biāo)(購自英國CambridgeIsotopeLaboratory),然后充分混勻。在4℃、13600g條件下離心15min,將上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)新的2mL離心管,在原來的離心管中重新加入1mL提取液,再提取1次。合并2次提取液,濃縮。用乙醚對濃縮液萃取3次,每次用乙醚1mL。將萃取液濃縮至干,再加入200μL乙醚;加入甲基化試劑(NTG)500μL,靜置20min;濃縮至干,再加入50μL正己烷充分混勻。置于-80℃冰箱中保存,用于定量研究。水楊酸的定量利用氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。直接在280℃的GC中進(jìn)樣,進(jìn)樣量為1μL,色譜柱利用HP-5MS毛細(xì)管柱(30m×0.25mmID,膜厚0.25μm)。柱溫采用程序升溫,60℃(4min)至200℃,20℃·min-1,至300℃,10min。氣譜/質(zhì)譜接口溫度280℃;EI離子源,電離能70eV。以99.999%高純氦氣作為載氣,柱流量1mL·min-1,以內(nèi)標(biāo)定量。1.7稻績效5.5和4.5%稻虱纓小蜂對水稻揮發(fā)物的行為反應(yīng)利用“Y”型嗅覺儀測定,嗅覺儀的構(gòu)造以及具體的生測方法同婁永根等。分別測定稻虱纓小蜂對下列成對揮發(fā)物源的行為反應(yīng):6.91、13.81、20.72、27.62、34.53或41.44μg水楊酸·株-1處理12h的稻株與其相應(yīng)對照稻株的比較;0.25、0.5、0.75、1.00或1.25mgH2O2·株-1處理12h的稻株與其相應(yīng)對照稻株的比較。同時(shí),也測定稻虱纓小蜂對41.44μg水楊酸(以相應(yīng)的緩沖液為對照)和1.25mgH2O2(以相應(yīng)的蒸餾水為對照)的行為反應(yīng),以明確水楊酸或H2O2本身是否對該蜂有引誘作用。在生測時(shí),每一氣味源所用的稻苗為10株。同時(shí),每測定8頭蜂換一批稻苗。對每一組處理的比較至少測定32頭蜂。所得的結(jié)果用χ2進(jìn)行檢驗(yàn)。1.8揮發(fā)油提取與測定揮發(fā)物的提取,利用固相微萃取技術(shù)(SPME)。具體所用的提取裝置與方法同Lou等(2005)。整個(gè)提取過程在28℃的空調(diào)室內(nèi)進(jìn)行。分別對下面處理的10根水稻植株提取揮發(fā)物:1.25mgH2O2·株-1處理12h的稻株及其相應(yīng)的對照稻株;6.91、20.72或34.53μg水楊酸·株-1處理12h的稻株及其相應(yīng)的對照稻株;褐飛虱為害12h的稻株及其相應(yīng)的對照稻株。揮發(fā)物提取時(shí)間為2h。各處理重復(fù)3次。揮發(fā)物的分離與鑒定利用氣譜(Agilent6890)-質(zhì)譜(Agilent5973)聯(lián)用儀。對固相微萃取捕集的揮發(fā)物,直接在250℃的GC進(jìn)樣口內(nèi)進(jìn)行熱解吸,解吸時(shí)間1min,無分流進(jìn)樣。色譜柱利用HP-5MS毛細(xì)管柱(30m×0.25mmID,膜厚0.25μm)。柱溫采用程序升溫,40℃(2min)至250℃(2min),6℃·min-1。以99.999%高純氦氣作為載氣,柱流量1.0mL·min-1。氣譜/質(zhì)譜接口溫度280℃;EI離子源,電離能70eV。通過核對譜庫(NIST98)及標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖,對揮發(fā)物的各組分進(jìn)行定性分析,并以正八烷(200μg·mL-1,進(jìn)樣量1μL)作為外標(biāo)對各揮發(fā)物組分進(jìn)行相對定量。1.9對稻株揮發(fā)物和其含量的比較對于行為生測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用χ2檢驗(yàn),水楊酸和H2O2含量的比較以及H2O2處理稻株的揮發(fā)物比較利用t檢驗(yàn)。對于其它揮發(fā)物數(shù)據(jù),則先進(jìn)行方差分析,當(dāng)差異顯著時(shí),再進(jìn)行Duncan’s新復(fù)極差法多重比較。2結(jié)果2.1對水稻的處理褐飛虱為害能迅速導(dǎo)致水稻體內(nèi)水楊酸和H2O2含量的上升(圖1)。水楊酸含量在褐飛虱為害后1h即顯著地高于相應(yīng)的未處理稻株,H2O2含量亦在為害后1.5h明顯地高于對照稻株。同時(shí),在測定的24h內(nèi),褐飛虱為害稻株中的水楊酸與H2O2濃度一直高于對照稻株。說明褐飛虱為害能激活水稻體內(nèi)的水楊酸和H2O2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外,與同病原菌感染一樣,褐飛虱為害誘導(dǎo)的H2O2含量的上升亦呈典型的雙峰型。2.22-42號處理對水稻含量的影響水稻經(jīng)H2O2(1.25mg·株-1)處理后4h,水楊酸含量比對照明顯上升(圖2)。2.3對水稻揮發(fā)物的影響行為生測結(jié)果表明(圖3),較高用量的水楊酸處理稻株所釋放的揮發(fā)物能明顯地引誘稻虱纓小蜂,而較低用量的水楊酸處理稻株及水楊酸本身(水楊酸引誘蜂數(shù):緩沖液引誘蜂數(shù)=13∶19)則對稻虱纓小蜂沒有引誘作用。與褐飛虱為害稻株相比,水楊酸(34.53μg·株-1)處理稻株對稻虱纓小蜂的引誘作用要明顯低于前者(褐飛虱為害稻株:水楊酸處理稻株=23∶9)(χ2=5.28,df=1,P<0.025)。在各種處理稻株中共捕集到16種主要揮發(fā)物組分,其中鑒定了14種,包括直鏈的烴類化合物9種,萜類化合物2種,醛類化合物2種,另外1種為水楊酸甲酯(表1～表3)。水楊酸處理能導(dǎo)致水稻揮發(fā)物總量明顯上升,并且釋放總量的多少與水楊酸的使用量呈正相關(guān)(表1)。當(dāng)水楊酸的使用量為20.72、34.53μg·株-1時(shí),處理水稻揮發(fā)物的釋放總量要明顯高于對照(表1)。從單個(gè)組分看,水楊酸處理能導(dǎo)致水稻釋放更多的十四醛、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷與未知物1和2,并同時(shí)誘導(dǎo)釋放水楊酸甲酯和正二十一烷。與揮發(fā)物總量的變化相似,這些釋放量增加和新產(chǎn)生的化合物亦大多與水楊酸的使用量呈正相關(guān)。此外,水楊酸處理會導(dǎo)致正十四烷含量的下降。水楊酸誘導(dǎo)的這些揮發(fā)物組分的變化有一些與褐飛虱為害誘導(dǎo)的變化相似:兩者都導(dǎo)致了正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷與未知物1和2含量的上升,并同時(shí)誘導(dǎo)釋放了正二十一烷(表3)。但也有一些存在差異:褐飛虱為害能導(dǎo)致芳樟醇、1-十四烯、正十四烷和正二十烷釋放量上升,而水楊酸處理不引起這些揮發(fā)物的增加,對于十四烷則反而下降;水楊酸處理能增加十四醛、正十五烷的量,并新釋放水楊酸甲酯,而褐飛虱為害不引起這些變化(表1,表3)。就褐飛虱為害稻株與水楊酸處理(34.53μg·株-1)稻株之間,揮發(fā)物也存在一定差異。與水楊酸處理稻株相比,褐飛虱為害稻株中少了水楊酸甲酯。此外,檸檬烯、正十五烷、十四醛和正二十烷的含量在褐飛虱為害稻株中也低于水楊酸處理稻株,而未知物2和正十四烷在前者中的濃度高于后者(表3)。2.4對水稻中作用體的揮發(fā)物組分的影響與水楊酸處理稻株相似,高用量的H2O2處理稻株所釋放的揮發(fā)物能對稻虱纓小蜂產(chǎn)生明顯的引誘作用,而低用量的H2O2及H2O2本身(H2O2∶蒸餾水=17∶15)則對稻虱纓小蜂無明顯引誘作用(圖4)。與水楊酸處理稻株相似,H2O2處理(1.25mg·株-1)稻株揮發(fā)物對稻虱纓小蜂的引誘作用亦明顯弱于褐飛虱為害稻株(褐飛虱為害稻株:H2O2處理稻株=24∶8)(χ2=7.03,df=1,P<0.01)。在H2O2處理(1.25mg·株-1)稻株中亦捕集到了與水楊酸處理稻株中相同的14種主要揮發(fā)物組分,并且H2O2處理亦能導(dǎo)致?lián)]發(fā)物總量的上升。H2O2處理能導(dǎo)致水稻釋放更多的芳樟醇、1-十四烯、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十烷與未知物2,并同時(shí)誘導(dǎo)釋放水楊酸甲酯和正二十一烷(表2)。H2O2誘導(dǎo)的一些揮發(fā)物組分的變化也與褐飛虱為害誘導(dǎo)的相似:兩者都增加了芳樟醇、1-十四烯、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十烷與未知物2的釋放量,并同時(shí)誘導(dǎo)釋放正二十一烷(表3)。但也存在一些差異:褐飛虱為害能導(dǎo)致正十四烷與未知物1釋放量上升,但H2O2處理不引起這些揮發(fā)物釋放量增加;H2O2處理能增加正十五烷的量,并新釋放水楊酸甲酯,而褐飛虱為害不引起這些變化(表2,表3)。就褐飛虱為害稻株與H2O2處理(1.25mg·株-1)稻株之間,揮發(fā)物也存在一定差異。與H2O2處理稻株相比,褐飛虱為害稻株中少了水楊酸甲酯。此外,檸檬烯、正十五烷、十四醛、正十七烷、正二十烷和二十一烷的含量在褐飛虱為害稻株中也低于H2O2處理稻株,而未知物2在前者中的濃度要高于后者(表3)。3對水稻措施的誘導(dǎo)本文的研究結(jié)果表明褐飛虱為害能迅速地導(dǎo)致水稻體內(nèi)水楊酸(為害后1h)和H2O2(為害后1.5h)含量的上升(圖1);這一時(shí)間明顯地早于褐飛虱為害誘導(dǎo)水稻釋放引誘稻虱纓小蜂揮發(fā)物所需的時(shí)間(在10頭雌成蟲·株-1為害情況下,水稻在約6h時(shí)能釋放引誘稻虱纓小蜂的揮發(fā)物)。外用水楊酸和H2O2處理的試驗(yàn)結(jié)果表明,水稻生理濃度范圍(試驗(yàn)用