上海交通大學(xué)微生物實驗課件實驗十一血清學(xué)試驗

實驗十一

凝集試驗

（Agglutinationassay）

酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)實驗要求掌握凝集試驗的原理、方法，結(jié)果判定和凝集效價的判定。掌握ELISA的基本原理，操作步驟，和ELISA的應(yīng)用。了解血清學(xué)試驗在病原微生物學(xué)中的應(yīng)用一、抗原的基本概念

抗原：凡能刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞，并能與抗體和致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。

抗原決定簇（抗原表位epitope）:抗原分子上的免疫活性區(qū)，負責和免疫活性細胞上的抗原受體和抗體相結(jié)合。有的抗原分子上可能只有一個抗原決定簇（抗生素等小分子），有的抗原分子上可能有多個抗原決定簇（如病毒、細菌等）。用病毒或細菌等抗原免疫動物機體后，機體所產(chǎn)生的抗體則為多克隆抗體，即通常所講的抗血清。二、抗體的基本概念

機體在抗原物質(zhì)的刺激下所形成一類與抗原特異性結(jié)合的血清活性成分為抗體（Antibody）?？贵w的化學(xué)本質(zhì)是免疫球蛋白。所有抗體的單體都由4條多肽鏈構(gòu)成：兩條重鏈和兩條輕鏈。

輕鏈N端1/2和重鏈N端1/4的氨基酸組成和序列變化較大，稱為可變區(qū)（variableregion,VL,VH）,肽鏈的其余部分變化不大，稱為恒定區(qū)（constantregion,CH,CL）。

可變區(qū)是與抗原結(jié)合的區(qū)域，決定抗體的特異性。

ELISA的基本原理

酶標記抗體或抗原可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在底物溶液中在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)（酶分子與抗體或抗原共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性）。顏色反應(yīng)的深淺與標本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。應(yīng)用：抗原鑒定、疾病診斷、抗體效價檢測、疫苗免疫效果評價等檢測抗原檢測抗體實驗步驟１：所有試劑回升到室溫２：標記好各自的反應(yīng)孔（每組2人，每組4個孔）３：抗體包被，４℃過夜，ＰＢＳＴ洗滌（該步驟試劑盒已完成）４：每組第１-3孔各加5０μl樣品稀釋液，然后第一孔加提供的大腸桿菌菌液5０μl，然后遞減稀釋至第2孔，從第2孔取出50μl丟棄。第3孔不加其他物質(zhì)，第4孔加50μl陽性標準對照物,２５℃作用30-60min．5：倒掉孔中液體，并在吸水紙上拍干，每孔立即加洗滌液ＰＢＳＴ溶液５０μl，室溫靜置２分鐘，拍打干凈，按上述方法再重復(fù)洗滌各孔3次。6：每孔加5０μl已稀釋的酶標記物，２５℃作用30-60min7：洗滌3次，同步驟5洗滌．8：加顯色試劑A5０μl,再加顯色試劑B5０μl,25℃暗處作用１５分鐘．9：每孔加反應(yīng)終止液５０μl,特別注意安全，觀察顏色變化.10:測定在４５０nm處測定吸光度值。所有的測試條都放回到板中統(tǒng)一測定以空白孔調(diào)零。

記錄各孔的OD值，確定陰性和陽性值。