實驗三 DNA的Feulgen染色法

實驗三DNA的Feulgen染色和細胞有絲分裂相的觀察

DNA是主要的遺傳物質(zhì)，主要分布在核的染色質(zhì)或有絲分裂過程中出現(xiàn)的染色體內(nèi)。自從1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以來,至今這種方法仍是DNA定量測定的主要染色方法之一。

一、實驗?zāi)康?/p>

1了解Feulgen反應(yīng)的基本原理。2熟悉傳統(tǒng)細胞化學(xué)實驗的基本實驗技能和操作方法。3掌握細胞分裂各期的主要特點。

二、實驗原理

DNA經(jīng)弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與Schiff試劑（無色品紅亞硫酸溶液）反應(yīng)，形成紫紅色的化合物，使細胞內(nèi)含有DNA的部位呈紫紅色陽性反應(yīng)。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個發(fā)色團，所以具有顏色。對照組預(yù)先用熱三氯醋酸或DNA酶處理，抽提去細胞中的DNA而得到陰性反應(yīng)，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。三、試劑1.Carnoy固定液：3份95%酒精加入1份冰醋酸。2.1mol/LHCL：準(zhǔn)確量取86.2ml濃鹽酸（比重1.18）加入到93.8ml蒸餾水中。3.Schiff試劑：稱1g堿性品紅于200ml煮沸的重蒸餾水中，5分鐘后斷電使其冷卻至55～50℃，過濾到一個棕色的試劑瓶中，加入1N

HCl

20ml，繼續(xù)冷卻至25℃，加入1g偏亞硫酸氫鈉，搖動瓶子使其溶解。密閉瓶口，置黑暗低溫處或冰箱內(nèi)（4℃左右），18～24小時后檢查，試劑如透明無色或呈淺黃色時即可使用，這就是Schiff試劑溶液。如有不同程度的紅色未褪，可加入1g活性炭，強烈震蕩一分鐘，仍在低溫下靜置過夜，然后用濾紙過濾后使用。密封瓶口，包以黑紙，在5℃以下冰箱內(nèi)可以保存半年。

4.亞硫酸水溶液(漂白液)：在200ml蒸餾水中，加入10ml

1N

HCl

和10ml

10%偏亞硫酸氫鈉水溶液（或1.0g固體）。此液在臨用前配制。否則會因SO2的的逸出而失效。5.5%三氯乙酸6.0.5%固綠酒精溶液（95%的酒精溶解）

四、實驗材料及實驗器材1.材料Carnoy液固定的大蒜根尖洋蔥根尖縱切永久制片馬蛔蟲卵切片永久制片2.實驗器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、溫度計、鑷子、解剖針、刀片、剪刀、冰箱、溫箱、天平、載玻片、蓋玻片、吸水紙、鏡頭紙、青霉素瓶、吸管、燒杯、量筒。

五、實驗方法和步驟（一）材料準(zhǔn)備

取大蒜若干頭，剝皮后置于盛有水的培養(yǎng)皿內(nèi)使其長出新根。待根尖長1cm時，剪下根尖固定在Carnoy固定液內(nèi)、保存?zhèn)溆?。（二）水?/p>

實驗時，從冰箱取出預(yù)先準(zhǔn)備好的大蒜根尖，分裝到若干個青霉素瓶中，用自來水洗3次，蒸餾水水洗3次，換1mol/L

HCl洗一次，傾去，換入預(yù)熱60℃的1mol/LHCl

3ml，放入恒溫水浴鍋中在60±0.5℃下水解8-15分鐘（視材料而定，水解時間可以從8分鐘延長至30分鐘）。然后吸去熱1mol/LHCl，換入冷1mol/LHCl洗1次，再用蒸餾水將根尖洗3次。

水解是本實驗成敗的關(guān)鍵之一。重要的是溫度，應(yīng)保持在60±0.5℃之間。如果溫度過高或時間過長，造成水解過度，醣與醛基之間的鍵被破壞，醛基流失到水解液中；反之，不能出現(xiàn)潛在的醛基，都不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。

（三）染色

吸凈水分，加入Schiff試劑避光染色40min~60min，用漂洗液漂洗2～3次，每次5min,然后經(jīng)自來水流水沖洗，再用蒸餾水洗2次后準(zhǔn)備壓片。（四）壓片法

取一根尖置于載玻片上，用刀片切下生長區(qū)部位（染成紫紅色），加一滴0.1%亮綠水溶液對染一分鐘，吸去亮綠液，加一滴清水或45%醋酸水溶液，加蓋玻片，用拇指輕壓使細胞分散均勻，鏡檢。（五）對照組預(yù)先用5%三氯醋酸（90℃）處理15min，然后再依次進行實驗步驟（二）（三）（四）。

六、有絲分裂各期觀察1大蒜根尖壓片的觀察

首先在低倍鏡下，區(qū)分根尖的分生組織區(qū)及延長組織區(qū)的細胞，然后，在高倍鏡下，觀察細胞核的形態(tài)，注意在你的片子上，是否有有絲分裂細胞，如有，你能找到細胞分裂期的幾個階段，其特征如何？（可參照附錄）

附錄：植物細胞分裂的幾個時期。

細胞周期分為間期及分裂期，按照有無核膜，核仁、染色體，以及染色體形態(tài)與分布位置的變化，細胞有絲分裂又分為前期、中期、后期和末期四個階段?，F(xiàn)將各期特點簡述如下，

（1）前期：此期的染色質(zhì)螺旋盤繞成一定數(shù)目的細而長的染色絲，此即染色體。染色體先是分散于核液中，以后，逐漸向核膜移動，在此時，核仁逐漸消失，核膜溶解。

（2）中期：染色體進一步盤繞，變短變粗，在細胞的中央（即赤道板）規(guī)則地排列成行，仔細觀察，可看到染色體兩側(cè)的紡錘絲。

（3）后期：姊妹染色體分別向細胞兩極移動，染色體達到兩極時染色體緊縮成團，染色體的輪廓逐漸變得不清楚，細胞質(zhì)中間部位（細胞的赤道板）形成細胞板。（4）末期：盤繞變粗的染色體又伸展開，此時，核仁、核膜又重新出現(xiàn)。

此外，間期細胞的細胞核有下述特點：核膜清楚，核內(nèi)結(jié)構(gòu)均勻，除異染色質(zhì)外，可見1－2個著色較深的核仁。而在進入細胞分裂期的細胞核，一般均大于間期細胞核。植物細胞的細胞質(zhì)分裂2洋蔥根尖縱切永久制片觀察（同大蒜根尖）3馬蛔蟲受精卵切片永久制片觀察馬蛔蟲是真核生物中染色體數(shù)目最少的物種，二倍體馬蛔蟲的染色體數(shù)目為2條或4條，三倍體為6條。在觀察切片時要注意所觀察卵的染色體數(shù)目的不同。注意：1)馬蛔蟲受精卵是動物細胞，在細胞分裂過程中與植物細胞有所不同。首先最明顯的不同就是，植物細胞的赤道板在后期可形成細胞