乙醇誘導(dǎo)的急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立

乙醇誘導(dǎo)的急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立

目前，酒精性肝炎已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。酒精性脂肪肝是過量酒精攝入后出現(xiàn)的一個(gè)早期的和可逆的臨床階段,可進(jìn)展成為酒精性肝炎、肝硬化甚至肝癌,應(yīng)引起高度重視。為深入研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的治療和預(yù)防藥物,需要建立一個(gè)簡單易行而又經(jīng)濟(jì)實(shí)用的動(dòng)物模型。傳統(tǒng)的酒精性脂肪肝模型常以大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,多采用灌胃或腹腔注射酒精的方法,實(shí)驗(yàn)周期約為1～16周。然而操作復(fù)雜、樣本量局限、實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)高且周期長等諸多缺點(diǎn)限制了其在高通量藥物篩選方面的應(yīng)用。本研究通過建立急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型,彌補(bǔ)了鼠模型在高通量藥物篩選方面的缺陷,以期為進(jìn)一步研究本病的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1繁殖與培養(yǎng)模式由南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞生物教研室斑馬魚平臺提供野生型AB品系斑馬魚。斑馬魚根據(jù)Westerfield方法養(yǎng)殖:照明14h,黑暗10h交替進(jìn)行,雌雄分開喂養(yǎng),定時(shí)給予飼料。取卵前一天,將雌雄以1∶1的比例放入交配缸中,插入擋板,次日清晨拔開擋板,收集胚胎培養(yǎng)于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中到5dpf。期間及時(shí)換水,剔除死卵。1.1.2藥物和試劑油紅O購于Sigma公司;無水乙醇和丙二醇由廣東光華化學(xué)廠提供;蘇木素和伊紅染液為南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1斑馬魚處理組細(xì)胞組受精卵發(fā)育到5dpf,在體式顯微鏡下挑選肝臟發(fā)育正常的幼魚288條,隨機(jī)均分為對照組、2%乙醇處理組、2.5%乙醇處理組、3%乙醇處理組,每組72條,置于六孔板中。處理組加入相應(yīng)體積濃度比無水乙醇,對照組給予斑馬魚培養(yǎng)用水(hank′ssolution)。為防止乙醇揮發(fā),加蓋后用Parafilm封條封閉,置于28.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于處理后4、24和32h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄各組生存率。1.2.2油紅/丙二醇溶液收集斑馬魚于染色皿中,4%多聚甲醛固定過夜,PBS洗滌2次,丙二醇從低濃度到高濃度滲透,0.5%油紅避光孵育過夜。同樣濃度丙二醇從高濃度到低濃度洗凈背景,80%丙二醇4℃冰箱保存。每組隨機(jī)挑選20條,Olympusszx10體式顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性情況(肝臟脂滴數(shù)≥3評判為脂肪肝)并進(jìn)行拍照記錄。1.2.3病理組織4%多聚甲醛固定斑馬魚過夜,不同濃度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟后包埋,4μm切片,行HE染色,光鏡觀察肝臟病理變化。1.3均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差t應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。作圖用Sigmaplot10.0軟件。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1用乙醇處理后的斑點(diǎn)魚一般情況2.1.1斑馬魚生存率測定乙醇對斑馬魚存活率的影響呈時(shí)間和濃度依賴性。2%、2.5%和3%乙醇處理組斑馬魚在處理后32h生存率分別為100%、(91.21±1.61)%和2%乙醇濃度為可耐受濃度,32h內(nèi)并不引起斑馬魚死亡(圖1)。2.1.2斑馬魚的行為與對照組相比,2%乙醇處理組斑馬魚處理24h時(shí)形態(tài)基本正常,觀察其活動(dòng)度增加,游動(dòng)異常,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)圈、竄動(dòng)。3%乙醇處理24h后存活下來的斑馬魚靜止不動(dòng),全部出現(xiàn)畸形(圖2)。2.5%乙醇處理組斑馬魚中部分出現(xiàn)畸形。2.2脂滴和2%乙醇處理對肝損傷的影響整體油紅染色觀察肝臟脂肪變性情況(肝臟脂滴數(shù)≥3評判為脂肪肝)(圖3a)。顯微鏡下分離對照組和2%乙醇處理組斑馬魚肝臟組織,發(fā)生脂肪變性后肝臟染色明顯變深,肝內(nèi)有點(diǎn)狀脂滴沉積,嚴(yán)重的脂滴布滿全肝(圖3b)。2%乙醇處理32h后肝臟明顯腫大,肝內(nèi)染色加深,有點(diǎn)狀脂滴沉積(圖3c)。根據(jù)上述評判標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)分析兩組脂肪肝發(fā)生率:與對照組相比,2%乙醇處理組32h后脂肪肝發(fā)生率明顯增高[(71.25±0.15)%vs(31.25±0.05)%,t=5.102,P=0.002],而24h時(shí),兩組脂肪肝發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(17.50±0.15)%vs(7.50±0.05)%,t=1.265,P=0.253](圖3d)。2.3斑馬魚肝臟急性毒性HE染色結(jié)果顯示對照組肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常,2%乙醇處理組斑馬魚處理32h后肝細(xì)胞明顯腫脹,脂滴將核擠至一邊,肝內(nèi)可見微多孔狀的脂滴(圖4)。3斑馬魚的建模研究酒精性脂肪肝是過量酒精攝入后出現(xiàn)的一個(gè)早期的和可逆的臨床階段,研究表明脂肪化的肝細(xì)胞更容易受到氧化壓力、內(nèi)毒素和藥物等因素的“二次打擊”,從而導(dǎo)致病情的進(jìn)一步發(fā)展。脂肪肝臨床癥狀不易察覺,往往被患者忽略,多數(shù)研究關(guān)注其后期病變,然而針對酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制的探索、藥物篩選同樣重要。為深入酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制和防治基礎(chǔ)研究,選擇一種理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型十分必要。經(jīng)典Liber-Decarli模型采用含酒精和全營養(yǎng)素的液體食料喂養(yǎng)大鼠,但由于大鼠厭酒,故而不能保證大鼠有較恒定的酒精攝入量。Tsukamato-French大鼠模型雖能控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的酒精攝入,但制作該模型需要一些技術(shù)上的訓(xùn)練,如胃內(nèi)導(dǎo)管的植入、維持,以保證24h持續(xù)注入酒精。所需的特殊設(shè)備價(jià)格昂貴,給人們的研究帶來諸多不便。在此基礎(chǔ)上,國內(nèi)的一些學(xué)者也致力于酒精性脂肪肝大鼠模型的改良工作,但始終存在著操作復(fù)雜、難于大規(guī)模飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)高且周期較長的問題,限制了其在高通量藥物篩選方面的應(yīng)用。近年來,斑馬魚因87%的基因與人類同源、具有體外受精和胚胎透明、易于養(yǎng)殖和在體觀察、方便控制實(shí)驗(yàn)條件和檢測等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。被廣泛應(yīng)用于疾病模型的建立和藥物篩選中。其在肝臟領(lǐng)域的研究層出不窮,如已經(jīng)建立的脂肪肝、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損害、肝癌模型,給了我們許多啟示[15,16,17,18,19,20]。與此同時(shí),有研究指出斑馬魚體內(nèi)擁有代謝酒精所需的關(guān)鍵酶,肝臟在胚胎發(fā)育的第4d便開始成熟,酒精可以直接加入水中,是進(jìn)行酒精性肝病研究的理想模式生物。本研究通過直接在斑馬魚培養(yǎng)用水中加入酒精的方法成功地建立急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型。此模型相對傳統(tǒng)大鼠模型有以下優(yōu)點(diǎn):(1)酒精是直接加入養(yǎng)魚水中,相對灌胃法或腹腔注射的方法操作較簡便;(2)幼魚是透明的,整體油紅染色后顯微鏡下可以直接觀察肝內(nèi)脂滴沉積情況;(3)斑馬魚產(chǎn)卵多,繁殖快,價(jià)格低廉,易于進(jìn)行高通量藥物篩選;(4)誘導(dǎo)脂肪肝的時(shí)間相對較短,有效的縮短了實(shí)驗(yàn)周期。以斑馬魚為模式生物建立模型,克服了傳統(tǒng)大鼠模型存在的問題,為進(jìn)一步研究本病的發(fā)病機(jī)制和高通量藥物篩選開辟了一條新路。2009年,Passeri等用濃度為2%的乙醇刺激4dpf的幼魚32h后成功地建立了急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型,本文建立的模型與其有以下區(qū)別:(1)魚的大小不同:文獻(xiàn)中報(bào)道斑馬魚在胚胎受精后的第4d肝臟開始發(fā)育,前4d卵黃囊能夠自身提供營養(yǎng)物質(zhì),無需喂食。如果禁食到第6d,斑馬魚易自發(fā)形成脂肪肝。因此實(shí)驗(yàn)用魚為4dpf最佳。但經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)到5dpf時(shí)斑馬魚肝臟發(fā)育更加完善,卵黃囊?guī)缀跸?油紅染色時(shí)能排除卵黃囊區(qū)域?qū)Ω闻K的影響。所以我們選擇5dpf的斑馬魚建立模型。(2)相同濃度乙醇處理后對斑馬魚生存率的影響不同:與國外報(bào)道一致,2%乙醇處理后斑馬魚在32h內(nèi)不出現(xiàn)死亡。3%乙醇處理32h后斑馬魚全部死亡,而在其報(bào)道中仍有20%～30%的斑馬魚存活。我們考慮由于地域差別等因素,斑馬魚對乙醇的耐受力仍有一定區(qū)別。值得提出的是,在Passeri等的研究中,他們在此模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用突變體斑馬魚揭示了srebp基因的激活在急性酒精性脂肪肝發(fā)病過程中起著關(guān)鍵性作用。這使得我們相信利用斑馬魚從分子水平研究疾病發(fā)生已不再是個(gè)難題