蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)[引言]蛋白質(zhì)是一類非常有用的物質(zhì)，在生物體的進(jìn)化過(guò)程中起著非常重要的作用。與其它化學(xué)試劑比擬：〔1〕分子量非常大；〔2〕在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定；〔3〕專一性的優(yōu)劣。分子生物學(xué)的開(kāi)展彌補(bǔ)了上述缺點(diǎn)，如定位突變、PCR使蛋白質(zhì)可能工程化生產(chǎn)。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)〔蛋白質(zhì)的構(gòu)造、功效預(yù)測(cè)〕涉及多學(xué)科的穿插領(lǐng)域，涉及材料學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、物理及計(jì)算機(jī)學(xué)科。其應(yīng)用范疇涵蓋了藥品、食品工業(yè)中的酶、污水解決、疫苗、化學(xué)傳感器等，設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)也不僅僅限于20種天然氨基酸，也涉及非天然氨基酸、有機(jī)/無(wú)機(jī)模塊。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的：〔1〕為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息；〔2〕探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)分類：〔1〕基于天然蛋白質(zhì)構(gòu)造的分子設(shè)計(jì)；〔2〕蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)。存在問(wèn)題：與天然蛋白質(zhì)比擬：〔1〕缺少構(gòu)造獨(dú)特性；〔2〕缺少明顯的功效優(yōu)越性。第一節(jié)基于天然蛋白質(zhì)構(gòu)造的分子設(shè)計(jì)概述蛋白質(zhì)構(gòu)造與功效的認(rèn)識(shí)對(duì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)至關(guān)重要，需要多學(xué)科的配合。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)以下：計(jì)算機(jī)模擬基因構(gòu)建功效分析計(jì)算機(jī)模擬基因構(gòu)建功效分析突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品對(duì)規(guī)定的活性進(jìn)展篩選。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)展表征，如測(cè)定序列、三維構(gòu)造、穩(wěn)定性及催化活性。專一型突變產(chǎn)物。計(jì)算機(jī)模擬。蛋白質(zhì)的三維構(gòu)造。在PDB中搜索，無(wú)紀(jì)錄即進(jìn)展X射線、NMR辦法或預(yù)測(cè)并構(gòu)建三維構(gòu)造模型。蛋白質(zhì)構(gòu)造與功效的關(guān)系。蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)的三個(gè)重要環(huán)節(jié)：突變位點(diǎn)和替代氨基酸確實(shí)定。擬定對(duì)蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域。功效上的重要位置。其它位置對(duì)蛋白質(zhì)突變體的影響。替代或加減殘基對(duì)構(gòu)造特性的影響。能量?jī)?yōu)化和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)辦法預(yù)測(cè)修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)造。預(yù)測(cè)構(gòu)造與原始蛋白質(zhì)構(gòu)造比擬，預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)性質(zhì)。上述設(shè)計(jì)工作完畢后，再進(jìn)展蛋白質(zhì)合成或突變實(shí)驗(yàn)，別離、純化并對(duì)新蛋白質(zhì)定性。二、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理1．內(nèi)核假設(shè)。假設(shè)蛋白質(zhì)獨(dú)特的折疊形式重要由蛋白質(zhì)內(nèi)核中的殘基互相作用決定。所謂內(nèi)核指蛋白質(zhì)在進(jìn)化過(guò)程中的保守區(qū)域，由氫鍵連接的二級(jí)構(gòu)造單元構(gòu)成。2．全部蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積且沒(méi)有重疊。3．全部?jī)?nèi)部的氫鍵都是最大滿足的〔主鏈和側(cè)鏈〕。4．疏水和親水基團(tuán)需要合理地分布在溶劑的可及與不可及外表。分布代表了疏水效應(yīng)的重要驅(qū)動(dòng)力。要在原子水平上分辨疏水和親水局部；外表安排少量疏水基團(tuán)、內(nèi)部安排少量親水基團(tuán)。5．金屬蛋白質(zhì)中配位殘基的替代要滿足金屬配位幾何。6．對(duì)于金屬蛋白，圍繞金屬中心的第二殼層的互相作用是最重要的。金屬的第二殼層普通涉及蛋白主鏈的互相作用，有時(shí)也參加同側(cè)鏈或水分子的互相作用。這些互相作用符合蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)規(guī)定；氫鍵固定在空間的配位位置。7．最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列。蛋白質(zhì)側(cè)鏈構(gòu)象決定于立體勢(shì)壘和氨基酸的位置。8．構(gòu)造及功效的專一性。三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的構(gòu)造—功效關(guān)系研究蛋白質(zhì)的序列、三維構(gòu)造、熱力學(xué)與功效性質(zhì)之間的關(guān)系對(duì)蛋白質(zhì)工程、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)非常重要。選擇突變殘基，最重要的信息來(lái)自于構(gòu)造特性。通過(guò)定位突變鑒定蛋白質(zhì)功效殘基、探討作用機(jī)理。這些研究為研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互相作用、酶催化的本質(zhì)提供理論根底，也為蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)提供理論根據(jù)，也可用于藥品開(kāi)發(fā)。定位突變技術(shù)分類為對(duì)一種或多個(gè)氨基酸進(jìn)展：〔1〕插入；〔2〕刪除；〔3〕替代。功效上的分析：最重要的是數(shù)據(jù)的解釋。全部突變檢測(cè)中共同存在的困難在于：如何區(qū)別功效殘基替代引發(fā)的效應(yīng)及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化引發(fā)的效應(yīng)？對(duì)于三維構(gòu)造未知的蛋白質(zhì)，這個(gè)問(wèn)題特別嚴(yán)重：不能擬定殘基的立體位置；殘基所處的周邊環(huán)境不擬定；殘基對(duì)溶劑的暴露程度；殘基間的互相作用。現(xiàn)在的檢測(cè)辦法：〔1〕在某些狀況下，溶解度與突變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定體現(xiàn)可作為構(gòu)造整體性的一種標(biāo)志。由于突變可能破壞蛋白質(zhì)的球形整體構(gòu)造，引發(fā)蛋白質(zhì)失活、不溶性以及在細(xì)胞種降解。突變引發(fā)的構(gòu)造變化可通過(guò)蛋白質(zhì)種引進(jìn)另一種突變來(lái)檢測(cè)。這種多重突變中單一突變是有加性的，偏離這個(gè)規(guī)那么闡明殘基間互相作用引發(fā)構(gòu)象的變化?！?〕熱力學(xué)分析可用于測(cè)量突變蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性及化學(xué)變化自由能，并可作為構(gòu)象整體性的檢測(cè)。〔3〕X射線晶體學(xué)及NMR譜可直接提供突變蛋白質(zhì)的高分辨率構(gòu)造及評(píng)定構(gòu)造整體性?！?〕圓二色散辦法用于分析突變體構(gòu)造。〔5〕單克隆抗體運(yùn)用分析一系列構(gòu)象敏捷的McAb的結(jié)合能力能夠探測(cè)突變蛋白的構(gòu)象變化。根據(jù)構(gòu)造信息擬定殘基的突變對(duì)于三維構(gòu)造已經(jīng)擬定、并克制劑、輔酶及受體的三維構(gòu)造的蛋白質(zhì)，根據(jù)氨基酸來(lái)推測(cè)專一性殘基的功效作用的辦法非常有效。殘基—配體上的受體基團(tuán)間的距離、取向決定它們之間形成的氫鍵、離子對(duì)或疏水互相作用。這樣的殘基通過(guò)定為突變?nèi)〈?，能證明某一殘基對(duì)鍵合過(guò)程的參加、每一種互相作用對(duì)復(fù)合物構(gòu)造的奉獻(xiàn)。例：酪氨酸—tRNA合成酶〔圖24〕。過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定性的闡明。底物專一性的認(rèn)識(shí)。蛋白質(zhì)三維構(gòu)造指時(shí)對(duì)突變?cè)O(shè)計(jì)謀略的協(xié)助。其它實(shí)驗(yàn)辦法鑒定功效殘基隨機(jī)突變、刪除分析及連接段掃描分析〔linkerscanningmutagenesis〕等實(shí)驗(yàn)辦法可鑒定功效殘基?！?〕隨機(jī)突變技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：用一種簡(jiǎn)樸辦法就能夠產(chǎn)生突變體。缺點(diǎn)：對(duì)突變沒(méi)有控制；必須進(jìn)展大量的突變產(chǎn)生大量的可解釋數(shù)據(jù)?！?〕刪除分析及連接段掃描分析涉及整個(gè)基因位置刪除或插入小數(shù)目的核苷酸，通過(guò)重組DNA技術(shù)很容易構(gòu)建。原理：運(yùn)用能識(shí)別序列內(nèi)的多重位點(diǎn)的限制酶能夠局部降解基因，并別離得到在單一位點(diǎn)被切斷的線性片段。為了進(jìn)展分散插入小的合成DNA片段，經(jīng)常編碼一種有限位點(diǎn)的片段〔linker〕，能夠把它配位到斷開(kāi)位置。為了建立分散刪除，在重新配位形成之前用外核酸酶降解DNA，目的是快速掃描編碼序列的長(zhǎng)度以及鑒定重要功效區(qū)域，然后可進(jìn)展單一氨基酸替代的更認(rèn)真的分析。掃描刪除分析曾用于鑒定鼠和人的粒狀白細(xì)胞大噬菌體激活因子〔GM-CSF〕的重要區(qū)域。GM-CSF的功效是刺激造血細(xì)胞的增值。通過(guò)突變?cè)?個(gè)氨基酸里刪除3個(gè)，再在E.coli體現(xiàn)及檢測(cè)活性。運(yùn)用蛋白質(zhì)同源性鑒定功效殘基每個(gè)殘基所起作用的信息來(lái)自不同原蛋白質(zhì)的序列比擬或一類含有對(duì)應(yīng)活性的蛋白質(zhì)的序列比擬。同源蛋白質(zhì)的保守的殘基是保持那類蛋白質(zhì)共同功效或是維持共同構(gòu)造的核心因素。相反，在一類蛋白質(zhì)內(nèi)變化的殘基看來(lái)對(duì)構(gòu)造及功效不重要，但涉及在分子識(shí)別中起作用的專一性。這兩個(gè)假設(shè)已用于指導(dǎo)位點(diǎn)突變分析蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：不能擬定效應(yīng)有突變引發(fā)還是構(gòu)造的微小變化引發(fā)。解決辦法：減少構(gòu)造的破壞。規(guī)定：預(yù)先盡量多理解蛋白質(zhì)的構(gòu)造、進(jìn)化保守及生物化學(xué)信息〔X-射線、NMR構(gòu)造信息，特別是蛋白質(zhì)分派體或底物形成的復(fù)合體的構(gòu)造信息、原子水平上構(gòu)造與活性的關(guān)系及分子互相作用等。〕突變方略：構(gòu)造并可進(jìn)展序列對(duì)準(zhǔn)的突變，使用不同二級(jí)構(gòu)造單元的轉(zhuǎn)換，如“l(fā)oop-交換〞。一組同源蛋白質(zhì)同感愛(ài)好的蛋白質(zhì)比擬，鑒定出高度保守的殘基，它們是突變、功效進(jìn)化的較好的候選殘基；而非保守殘基即涉及每個(gè)蛋白質(zhì)的獨(dú)特功效。如底物、專一性。優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)換的序列與蛋白質(zhì)的整體構(gòu)造協(xié)調(diào)，突變對(duì)構(gòu)造破壞少。四、天然蛋白質(zhì)的剪裁分子剪裁：在天然蛋白質(zhì)的改造中替代1個(gè)肽段或一種構(gòu)造域。反平行四螺旋束Rop重新設(shè)計(jì)的成功例子。LmRop與WtRop類似地折疊證明了蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理中的內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)構(gòu)造對(duì)殘基的替代有一定的容忍度，即構(gòu)造與功效有一定的穩(wěn)健度。不同的氨基酸序列含有相近的設(shè)計(jì)構(gòu)造。第二節(jié)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)一、引言概念：反折疊研究：根據(jù)所但愿的蛋白質(zhì)構(gòu)造及功效設(shè)計(jì)序列，從相反的方向理解決定蛋白質(zhì)構(gòu)造及功效的根本物理、化學(xué)規(guī)律及蛋白質(zhì)折疊過(guò)程與環(huán)節(jié)。全新蛋白質(zhì)合成屬于另一類蛋白質(zhì)工程，它合成含有新穎的構(gòu)造及功效的蛋白質(zhì)。選擇序列的辦法：生物進(jìn)化；全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)。全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)涉及從頭構(gòu)造設(shè)計(jì)和從頭功效設(shè)計(jì)。二、蛋白質(zhì)構(gòu)造的從頭設(shè)計(jì)中心問(wèn)題：設(shè)計(jì)一種含有穩(wěn)定基獨(dú)特的三維構(gòu)造的序列。根本障礙：線性聚合鏈的構(gòu)象熵。RTln10100=568.48kj/mol。方略：〔1〕使互相作用的強(qiáng)度與數(shù)目達(dá)成最大?！?〕通過(guò)共價(jià)穿插連接減小折疊的構(gòu)象熵。根據(jù)第一原理設(shè)計(jì)一種蛋白質(zhì)，我們必須依賴于分析構(gòu)造的天然蛋白質(zhì)中的二級(jí)構(gòu)造單元，例如螺旋、β疊片、環(huán)以及轉(zhuǎn)折，得到某些構(gòu)造知識(shí)，這些知識(shí)涉及氨基酸形成二及構(gòu)造的傾向性等。對(duì)于螺旋已有較好的認(rèn)識(shí)，近來(lái)重點(diǎn)研究二級(jí)構(gòu)造在三維空間形成的獨(dú)特的構(gòu)象通過(guò)長(zhǎng)程互相作用可控形成超二級(jí)構(gòu)造。螺旋合成、β折疊、ββα模塊形成規(guī)律較清晰，設(shè)計(jì)合成成功率較高。復(fù)雜的三級(jí)折疊和四級(jí)構(gòu)造可分解為有效的二級(jí)構(gòu)造單元，如：螺旋、折疊、串、轉(zhuǎn)角通過(guò)loop連接為三級(jí)構(gòu)造。對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)造和穩(wěn)定性較好的認(rèn)識(shí)，在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中可安排殘基的最大的疏水互相作用形成一種嚴(yán)密的疏水內(nèi)核。離子互相作用與氫鍵可進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)造。另一種途徑是根據(jù)主鏈的構(gòu)象限制設(shè)計(jì)二級(jí)構(gòu)造。全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的方略：1．二級(jí)構(gòu)造模塊單元的自組裝最簡(jiǎn)樸、最直接的方略：合成單一的兩親性的二級(jí)構(gòu)造單元〔α螺旋、β折疊〕作為多肽鏈的片段模塊，然后復(fù)制這些片段并把它們連接位整個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)造。疏水外表埋藏在內(nèi)核形成嚴(yán)密的蛋白質(zhì)構(gòu)造中。模塊辦法的特點(diǎn)：〔1〕它是最簡(jiǎn)樸的?！?〕容易合成。與單鏈天然類蛋白質(zhì)比擬，缺點(diǎn)：〔1〕蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差?！?〕構(gòu)造的簡(jiǎn)樸重復(fù)。α螺旋通過(guò)氫鍵達(dá)成構(gòu)造穩(wěn)定，單一α螺旋在溶液中是穩(wěn)定的。螺旋設(shè)計(jì)使用的方略：〔1〕使用大的、能形成螺旋傾向的殘基，如Leu/Glu/La等?！?〕使用適宜的基團(tuán)去除端基的電荷，避免與螺旋偶極不適宜的電荷互相作用?！?〕使用極化或荷電氨基酸引入穩(wěn)定的氫鍵或在螺旋中相隔一圈殘基間的例子互相作用?！?〕使用在螺旋中相隔一圈的殘基間疏水的范德華互相作用?！?〕使用芳香-荷電或芳香-硫的互相作用。最簡(jiǎn)樸的在自然界中觀察到的α螺旋構(gòu)造是coiled-coil及四螺旋束。這些構(gòu)造在全新蛋白質(zhì)領(lǐng)域初次通過(guò)模塊辦法設(shè)計(jì)成功。Degrado的工作：四螺旋束被成功應(yīng)用于n螺旋束的設(shè)計(jì)中。不適宜的構(gòu)象熵由非共價(jià)互相作用〔氫鍵、電荷-電荷、疏水互相作用〕賠償。兩親螺旋的聚集重要是基于疏水互相作用提供足夠的結(jié)合能去驅(qū)動(dòng)折疊平衡。不適宜的折疊熵的作用在實(shí)踐中逐步由結(jié)合足夠數(shù)目的疏水殘基所克制。Coiled-coil模型體系：由2-4個(gè)α螺旋彼此以平行或反平行堆積在一起，螺旋的穿插角靠近20°。Hodges的工作：設(shè)計(jì)7肽重復(fù)構(gòu)成的Coiled-coil及其特性。圖2-8途中序列設(shè)計(jì)規(guī)定同時(shí)穩(wěn)定α螺旋二級(jí)構(gòu)造、雙條螺旋間的互相作用。設(shè)計(jì)合成：〔1〕考慮疏水界面、離子間互相作用。成果合成的構(gòu)造比天然構(gòu)造更穩(wěn)定?！?〕長(zhǎng)度：最少含有29個(gè)殘基才干自由組裝成Coiled-coil?！?〕二聚界面變化疏水接觸的影響?！?〕兩個(gè)α螺旋之間增加一種二硫橋，加強(qiáng)了穩(wěn)定性?！?〕二硫橋?qū)oiled-coil構(gòu)造穩(wěn)定性的加性效應(yīng)。O’shea的工作：異二聚體Coiled-coil的從頭設(shè)計(jì)。結(jié)論：〔1〕分子間鹽橋可穩(wěn)定復(fù)合物構(gòu)造。〔2〕形成異二聚體的傾向不不大于均二聚體10萬(wàn)倍。純化肽表征、pH、離子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)成果證明：殘基的接觸決定Coiled-coil的寡聚態(tài)。四螺旋束模型體系：Degrado的工作：16殘基的兩親螺旋，組裝依賴于濃度。α1、α2、α4的穩(wěn)定性比擬。Chin的工作：78肽螺旋Coiled-coil與四螺旋束的比擬：都有兩親螺旋。疏水面的寬窄。β折疊片蛋白的研究現(xiàn)在的研究集中在轉(zhuǎn)折序列的設(shè)計(jì)，研究折疊協(xié)同作用及整體的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)折含有形成β折疊片的高傾向性，也含有聚集的傾向。對(duì)于模塊設(shè)計(jì)，什么特性是最根本的？與否有設(shè)計(jì)形成二級(jí)構(gòu)造及自組裝肽的普通規(guī)律？〔1〕自組裝重要涉及疏水互相作用，設(shè)計(jì)的序列必須是兩親性的。極性和非極性的殘基的周期性對(duì)二級(jí)構(gòu)造的形成及自組裝起著決定作用。如：α螺旋形成者構(gòu)成的序列，極性/非極性周期為2，形成自組裝的β折疊。β形成者構(gòu)成的序列，極性/非極性周期為3，4，那么形成α螺旋。2．配體誘導(dǎo)組裝第二個(gè)方略是使用一種配體〔如金屬離子〕誘導(dǎo)模塊蛋白片段的合成。在蛋白構(gòu)造中幾個(gè)互相作用片段的界面處設(shè)計(jì)一種配位結(jié)合位點(diǎn)，如果這個(gè)位點(diǎn)對(duì)配體有很高的親和力，那么結(jié)合配體的適宜的自由能將充足克制熵消耗并驅(qū)動(dòng)肽自組裝。例：Lieberman和Sasaki的Fe(Ⅱ)誘導(dǎo)組裝15肽兩親α螺旋雙吡啶Ghadiri的Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ru(Ⅱ)的優(yōu)到組裝15肽兩親α螺旋雙吡啶3．通過(guò)共價(jià)穿插連接實(shí)現(xiàn)它的自組裝肽鏈的構(gòu)象熵是涉及全新蛋白質(zhì)的重要障礙，共價(jià)穿插連接可減少構(gòu)象熵。自然界唯一用于穿插連接的辦法是二硫鍵。在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中也使用其它辦法。如Richardson,Erickson等在Betabillin的設(shè)計(jì)中使用稱為DAB的新的穿插連接辦法。不使用二硫鍵和人工連接片段的辦法：賴氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)，谷氨酸、天冬氨酸的側(cè)鏈羧酸彼此間能形成肽鍵。缺點(diǎn)：造成枝杈構(gòu)造。優(yōu)點(diǎn)：鏈穿插連接限制了鏈彼此間的位置，因而減少了形成獨(dú)特構(gòu)造的熵消耗。4．在合成模板上肽的組裝Mutter研究組開(kāi)展了模板組裝合成蛋白〔TASPs〕辦法。不使用天然蛋白質(zhì)中的turn和loops連接二級(jí)構(gòu)造單元，而用人工模塊。α螺旋和β折疊股在一種特殊折疊過(guò)程有一種對(duì)的的相對(duì)取向。TASP分子的螺旋和股通過(guò)模板構(gòu)造導(dǎo)向形成所但愿的構(gòu)象。他們使用的模板是寡肽，如：環(huán)十聚體。這個(gè)模板用于形成兩個(gè)反平行β折疊股，通過(guò)一種在一端的Pro-Gly轉(zhuǎn)折和一種在另一端的二硫鍵形成兩個(gè)反平行的β折疊股。特點(diǎn)：〔1〕有一種環(huán)構(gòu)造，因此構(gòu)象因受到限制而較擬定，殘基側(cè)鏈的取向也較擬定?！?〕每條肽鏈顯示最低程度的濃度依賴關(guān)系，但是一旦連接到模板上，它們的構(gòu)造傾向于穩(wěn)定并且不依賴濃度。缺點(diǎn)：能模擬單鏈肽而不能模擬天然蛋白的性質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：TASP方略能模擬天然蛋白的核心性質(zhì)。Sasaki研究組使用卟啉作模板連接α兩親螺旋的4條復(fù)制序列得到的最后蛋白質(zhì)Helichrome形成穩(wěn)定的球形構(gòu)造，并且含有酶活性。5．線性多肽折疊為球狀構(gòu)造全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)追求的目的之一是不用模板或穿插連接而通過(guò)線性多肽折疊形成球形確實(shí)定的三維構(gòu)造。把一種線性肽折疊形成獨(dú)特的三維構(gòu)造的重要障礙是構(gòu)象熵，這需要精心設(shè)計(jì)一系列的互相作用才干穩(wěn)定構(gòu)造。這方面的工作已獲得重大進(jìn)展。第一種成功例子是Degrado研究組完畢的α4構(gòu)造。最小化途徑：把全新設(shè)計(jì)的復(fù)雜性簡(jiǎn)化為幾個(gè)涉及天然蛋白穩(wěn)定性的核心特性并優(yōu)化。穩(wěn)定α4的最重要的特性：α螺旋明顯的兩親性；形成明顯的疏水核。最小化途徑的缺點(diǎn)：〔1〕構(gòu)造簡(jiǎn)樸且有更多的重復(fù)局部；〔2〕重復(fù)的序列使構(gòu)造易變難于精確測(cè)定；〔3〕缺少天然蛋白那樣好的互補(bǔ)堆積。對(duì)α4的修飾：用非極性側(cè)鏈殘基Val、Phe、Ile替代埋藏的殘基賴氨酸，使之含有更多的構(gòu)象限制、增加螺旋間堆積的立體互補(bǔ)性。引入一種金屬結(jié)合位點(diǎn)可減少鏈內(nèi)側(cè)柔性。四螺旋束Felix的設(shè)計(jì)：Hecht研究組完畢。設(shè)計(jì)的目的：合成一種由不同側(cè)鏈間特殊互相作用所穩(wěn)定的獨(dú)特的三維構(gòu)造的類天然蛋白。設(shè)計(jì)的特點(diǎn)：避免了簡(jiǎn)樸的重復(fù)序列；四螺旋中每一條都不同；每條螺旋本身沒(méi)有重復(fù)的片段；涉及19種天然氨基酸。設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：〔1〕4條α螺旋均為兩親性?！?〕引入二硫鍵：作用是減少并穩(wěn)定構(gòu)象熵；它可探測(cè)第一條及第四條鏈彼此間的取向?！?〕結(jié)合了“負(fù)設(shè)計(jì)〞的某些特性。設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)：〔1〕不是非常穩(wěn)定；〔2〕沒(méi)有一種獨(dú)特的較好堆積的疏水內(nèi)核。構(gòu)建的合成基因在E.coli中的體現(xiàn)的蛋白質(zhì)成果：〔1〕譜學(xué)研究證明了Felix折疊成嚴(yán)密的球形構(gòu)造；〔2〕CD譜證明α螺旋在蛋白中占優(yōu)勢(shì)；〔3〕Cys11-Cys71二硫鍵的形成闡明它們?cè)谌S空間構(gòu)造上彼此靠近，第一條α螺旋堆積靠近第四條α螺旋；〔4〕二硫鍵在分子內(nèi)而不是在分子間；〔5〕熒光譜證明在位置15的色氨酸埋藏在小極性環(huán)境中；〔6〕色氨酸靠近Cys11-Cys71二硫鍵。Goraj等設(shè)計(jì)的Octarellin：為8股α/βbarrel〔丙糖磷酸異構(gòu)酶〕。構(gòu)造單元是turn-βstrand-turn-αhelix。構(gòu)建的合成基因在E.coli中的體現(xiàn)的蛋白質(zhì)成果：存在有序構(gòu)造；8次重復(fù)序列的蛋白處在一種嚴(yán)密的球形折疊構(gòu)造與尿素誘導(dǎo)的非折疊的協(xié)同-2態(tài)過(guò)渡態(tài)。Qunn等設(shè)計(jì)的Betadoublet的β折疊蛋白質(zhì)：設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：〔1〕每一種轉(zhuǎn)折以及大多數(shù)β折疊股中包含一種荷電殘基；〔2〕含有由二硫鍵連接的兩個(gè)同樣的β折疊片；〔3〕構(gòu)筑了疏水內(nèi)核模型，并采用點(diǎn)外表可視化殘基間的堆積；構(gòu)建的合成基因在E.coli中的體現(xiàn)的蛋白質(zhì)成果：〔1〕二級(jí)構(gòu)造中占優(yōu)勢(shì)的是β。〔2〕能夠加熱去折疊。6．基于組合庫(kù)的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)組學(xué)涉及天然蛋白質(zhì)的多樣性、互相作用、構(gòu)造及功效。組合庫(kù)設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是埋藏疏水局部。一種慣用的辦法是基于極性與非極性的“二元模式。〞“二元模式〞規(guī)定〔1〕有助于形成二級(jí)構(gòu)造；〔2〕埋藏疏水局部。“二元模式〞可用于二級(jí)構(gòu)造的片段，一面完全親水，一面完全疏水。缺點(diǎn)是沒(méi)有完全考慮內(nèi)核的堆積。第二代二元編碼蛋白庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)：〔1〕由原來(lái)的74個(gè)殘基改為104個(gè)殘基；〔2〕對(duì)轉(zhuǎn)折區(qū)域作了些修改；〔3〕最重要的修飾是4條螺旋中的每條加6個(gè)殘基；成果：任取5個(gè)證明蛋白質(zhì)是單體且螺旋程度很高；產(chǎn)生出類似天然蛋白質(zhì)的全新蛋白。運(yùn)用組合庫(kù)尋找全新蛋白質(zhì)在以下方面獲得了成功：α螺旋、β折疊片、單體、自組裝為有序的排列、堆積為天然蛋白質(zhì)、超熱穩(wěn)定性、結(jié)合輔因子自的能力、催化活性。三、蛋白質(zhì)的功效設(shè)計(jì)功效設(shè)計(jì)重要涉及鍵合及催化。途徑：〔1〕反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，變化功效；〔2〕從頭設(shè)計(jì)功效蛋白質(zhì)。1．通過(guò)反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新功效執(zhí)行特別生物功效的天然蛋白質(zhì)能通過(guò)反向擬合獲得新的活性。通過(guò)修飾天然構(gòu)造得到專一性及活性變化的蛋白質(zhì)是切實(shí)可行的，并在DNA結(jié)合專一性、變化輔助因子專一性、底物專一性獲得成功?！?〕引入金屬結(jié)合位點(diǎn)使金屬—溶菌酶的活性均優(yōu)于天然酶?！?〕位點(diǎn)專一DNA裂解螯合劑EDTA—序列專一的DNA裂解蛋白?！?〕通過(guò)變化抗體loop區(qū)免疫體系能產(chǎn)生性的結(jié)合專一性。2．鍵合及催化的從頭設(shè)計(jì)圖2-22。3．在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點(diǎn)α螺旋引入金屬結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)：全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)除折疊成預(yù)想的構(gòu)造，還要考慮結(jié)合位點(diǎn)和催化性質(zhì)。Degrado和Regan研究組在α4設(shè)計(jì)合成后，又進(jìn)展了修飾使之含有金屬蛋白結(jié)合位點(diǎn)—能結(jié)合Zn2+的四周體結(jié)合位點(diǎn)，并為催化活性留有余地。在大腸桿菌E.coli中體現(xiàn)的蛋白質(zhì)表征：〔1〕Zn2+的解離常數(shù)為2.5×10-8mol/L?！?〕結(jié)合位點(diǎn)在單一蛋白質(zhì)的單體內(nèi)?！?〕結(jié)合金屬后蛋白質(zhì)的二級(jí)構(gòu)造沒(méi)有變化，變?yōu)楦鼮橛行虻臉?gòu)造。〔4〕結(jié)合Zn2+后增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性?！?〕半胱氨酸巰基對(duì)結(jié)合是最重要的。β折