革蘭陰性桿菌的主要耐藥機(jī)制

革蘭陰性桿菌的重要耐藥機(jī)制今天我給大家解說的是革蘭陰性桿菌的重要耐藥機(jī)制。首先我們復(fù)習(xí)一下細(xì)菌耐藥性的分類，細(xì)菌耐藥性的分類重要分為天然耐藥和獲得性耐藥，天然耐藥是指某微生物種的全部菌株含有相似的內(nèi)在特性，由染色體介導(dǎo)，普通直接傳給子代，是該菌的特性，能夠用于鑒定細(xì)菌。例如銅綠假單胞菌，對復(fù)方西諾敏是天然耐藥，克雷伯菌對氨芐西林天然耐藥等等。而獲得性耐藥是指發(fā)生在一種菌種或菌屬中的部分菌株，發(fā)生的比例會隨時間的變化而變化，普通由可轉(zhuǎn)移的DNA例如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等介導(dǎo)，并可水平傳輸，也能夠垂直傳輸，在缺少抗菌藥品的選擇壓力時，耐藥性有時會消失。而獲得性耐藥是我們今天解說的重點(diǎn)。細(xì)菌對抗菌藥品的耐藥性重要分為下面四種。第一產(chǎn)生滅活酶；第二，細(xì)胞通透性的變化，特別是細(xì)胞膜通透性的變化；第三，主動泵出；第四，對抗菌藥品作用靶位的修飾變化。而前面三種重要是革蘭陰性桿菌的耐藥機(jī)制。最后一種經(jīng)常體現(xiàn)在革蘭陽性菌中。我們今天解說的也是以前三種耐藥機(jī)制為主。首先我們解說一下滅活酶。這是一張全部耐藥機(jī)制的簡易圖，我們能夠看到右上方有兩個耐藥機(jī)制，第一種是由于某孔蛋白興奮性的障礙造成抗菌藥品不能夠順利地通過細(xì)菌的細(xì)胞膜，而直接在細(xì)胞膜外游走，不能發(fā)揮它的作用。另一種就是泵出機(jī)制，由于細(xì)胞膜上的泵將細(xì)胞膜內(nèi)的抗菌藥品泵出細(xì)胞外，使抗菌藥品在細(xì)胞內(nèi)的濃度大大減少，本圖右下方所指的就是滅活酶的作用機(jī)制，細(xì)菌對進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗菌藥品有兩種滅活酶的作用方式，第一是將抗菌藥品水解掉，第二是將抗菌藥品進(jìn)行修飾或者將其本身的靶位進(jìn)行修飾，使抗菌藥品不能發(fā)揮正常的作用。這張圖的左上方指的是細(xì)菌的細(xì)胞對于抗菌藥品作用的靶位發(fā)生了變化，因此，抗菌藥品不能夠順利地結(jié)合在作用的靶位上，從而失去了本身發(fā)揮作用的能力。左下方這一張圖表達(dá)的是抗菌藥品進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)當(dāng)通過正常的途徑發(fā)揮其作用，而此時細(xì)菌對因此產(chǎn)生一種慣用通路使抗菌藥品不能發(fā)揮其作用，以上機(jī)制是細(xì)菌的重要耐藥機(jī)制的介紹圖。下面我們介紹細(xì)菌的產(chǎn)酶機(jī)制。我們復(fù)習(xí)一下滅活酶的定義，滅活酶是指細(xì)菌產(chǎn)生一種或多個水解酶，或者是鈍化酶，來水解或修飾進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗菌藥品，使之達(dá)成靶位之前失去活性，是最常見的耐藥機(jī)制。這類酶重要分為β—內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷類鈍化酶、喹諾酮類DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶。下面，我們介紹一下β—內(nèi)酰胺酶。在介紹β—內(nèi)酰胺酶之前我們能夠理解一下微生物實(shí)驗(yàn)室檢測β—內(nèi)酰胺酶的某些實(shí)驗(yàn)辦法，對于簡樸的陽性菌的β—內(nèi)酰胺酶，我們能夠用β—內(nèi)酰胺酶紙片協(xié)同檢測，這在其它的解說中會為大家介紹到。而這里介紹的重要是通過耐藥表情的方式進(jìn)行檢測。這張圖片顯示的是紙片協(xié)同法檢測β—內(nèi)酰胺酶。我們首先能夠看到在紙片上標(biāo)注了CAZ的紙片是單劑量含有頭孢他啶的紙片，而這個白紙片上面我們加了某些酶克制劑。當(dāng)紙片的距離由近漸遠(yuǎn)的時候那么它之間的協(xié)同就會削弱，這個時候我們就懂得抗菌藥品以及酶克制劑的作用能夠?qū)⑦@個細(xì)菌的耐藥性減少，因此，這是一種檢測β—內(nèi)酰胺酶的比較適合臨床應(yīng)用的辦法，叫做紙片協(xié)同法。這一種檢測β—內(nèi)酰胺酶的辦法是三維實(shí)驗(yàn)法，這是一種典型的檢測酶的辦法，它能夠檢測大部分β—內(nèi)酰胺酶，下面我們簡要介紹一下它的實(shí)驗(yàn)原理。首先我們在平皿中均勻地涂布ATCC25922細(xì)菌，普通的濃度是0.5個單位，之后我們再平皿的正中間貼上抗生素紙片，檢測不同的酶貼的抗生素紙片不同，例如超廣譜β—內(nèi)酰胺酶我們貼的是三代頭孢，而頭孢菌素酶我們貼的就是頭孢西丁，如果是碳?xì)涿赶┟富蛘呤蔷鷮倜钢惖?，我們就能夠貼美羅培南等碳?xì)涿赶╊惖乃幤?，貼好紙片后我們在距離紙片5毫米的位置上打一種細(xì)長條的口，這個口三度和普通波片的寬度類似，在打好孔之后，我們將孔內(nèi)的紙，用小凹槽條給它挖掉，形成一種凹槽，在這個凹槽內(nèi)滴入，這個凹槽叫做加樣槽，我們在這個加樣槽內(nèi)滴入我們帶待測的霉素滴液，當(dāng)?shù)稳朊顾氐我汉?，酶就會沿著這個紙由中心向四周擴(kuò)散，形成一種酶的分布區(qū)，同時，由于紙片的抗菌藥品的濃度由高到低，也形成一種擴(kuò)散區(qū)，當(dāng)它們兩個相交的時候，這個酶，帶特指的酶就作用于細(xì)菌藥品，如果它產(chǎn)生了β—內(nèi)酰胺酶，它就會將我們待測的，它就會將我們放置在中間的抗菌藥品水解掉。此時，由紅色和黑色交叉的區(qū)域就形成了一種沒有抗菌藥品的區(qū)域。因此，底部的25922菌就會沿著這個區(qū)域縫內(nèi)生長，形成一種矢狀菌苔，一旦出現(xiàn)了矢狀菌苔，就闡明我們在加樣槽中加的待測菌產(chǎn)生了我們需要的檢測的β—內(nèi)酰胺酶。在理解了檢測β—內(nèi)酰胺酶的辦法后，我們再復(fù)習(xí)一下β—內(nèi)酰胺酶的簡樸分類。β—內(nèi)酰胺酶分為400多個，現(xiàn)在我們將它重要分成染色體介導(dǎo)和質(zhì)粒介導(dǎo)的兩大類。普通這兩大類中涉及了全部的β—內(nèi)酰胺酶，而富有代表性的就是頭孢菌素酶、碳青霉烯酶以及我們經(jīng)常所說的超廣譜β—內(nèi)酰胺酶。下面我們下簡要介紹一下頭孢菌素酶，它的分子量大概為39000左右，其等電點(diǎn)大多是不不大于9.0，能分解三代頭孢菌素及單環(huán)酰胺類抗菌藥品，不被β—內(nèi)酰胺酶克制劑所克制，但能夠被氯唑西林所克制。產(chǎn)生該酶的菌涉及大部分腸桿菌科細(xì)菌，如腸桿菌屬的某些菌屬，弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根式菌、普魯菲登式菌以及粘質(zhì)沙雷菌等等。根據(jù)表型能夠?qū)㈩^孢菌素酶分為低基礎(chǔ)水平持續(xù)體現(xiàn)，低基礎(chǔ)水平和高誘導(dǎo)產(chǎn)生，高基礎(chǔ)水平持續(xù)體現(xiàn)等。下面這張圖我們就以實(shí)例給大家介紹阿斯菌酶、β—內(nèi)酰胺酶以及其它表型的酶類測定。首先我們看一下右上方的這一張圖，待測14號菌的圖片。我們中間懂得紙片是頭孢曲松，是一種三代頭孢，在它上北下南左西右東的這四個方向上我們拉了四個槽，在這個槽內(nèi)我們加了14號菌的酶粗提液，上面這個是沒有加任何克制劑的酶粗提液，右邊是加了克拉維酸和酶粗提液，左邊是加了氯唑西林酶粗提液，而下方是加了酶粗提液以及克拉維酸和氯唑西林兩種酶克制劑。對于阿斯菌酶的檢測而言，我們前面講過，該酶不被克拉維酸所克制，但是被氯唑西林所克制，因此我們在看這張圖的時候，會清晰地體現(xiàn)。一種什么概念呢？就是上面有酶粗提液的菌，單加酶粗提液的時候，14號菌產(chǎn)生的酶能夠?qū)㈩^孢曲松水解形成矢狀苔，而加入了克拉維酸的這邊，右邊，即使加了克拉維酸，但是它并沒有把酶粗提液的酶克制住，因此矢狀苔仍然存在，而在左側(cè)加了氯唑西林這一邊酶粗提液當(dāng)中的酶成分被氯唑西林所克制，因此，頭孢曲松即使發(fā)揮其作用，對于25922原則菌株形成了非常嚴(yán)的切記，因此14號待測菌產(chǎn)生的就是阿斯菌酶。另一類β類酰胺酶是我們最常聽到的超廣譜β—內(nèi)酰胺酶，超廣譜β—內(nèi)酰胺酶是質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基β—內(nèi)酰胺類及氨曲南等單環(huán)酰胺類抗生素的一種酶類。并可被克拉維酸等β—內(nèi)酰胺酶克制劑所克制。在分子生物學(xué)分類中，超廣譜β—內(nèi)酰胺酶屬于A類酶，而在Bush分類中屬于2be類酶。那么回到上面一張圖片，下面我們看左上方的這張圖，剛剛講到，在最上方的這個加樣槽中，我們緊加入酶粗提液，而在右邊，我們加入了克拉維酸，在對8號待測菌的酶型檢測中顯示到我們在加入左側(cè)加入氯唑西林的過程當(dāng)中，這個酶并沒有被氯唑西林所克制，而右側(cè)再加入克拉維酸的過程中，8號待測菌產(chǎn)生的酶被克拉維酸所克制，因此，矢狀苔消失，形成了克拉維酸克制陽性實(shí)驗(yàn)，因此8號待測菌的體現(xiàn)酶型就是超廣譜β—內(nèi)酰胺酶。超廣譜β—內(nèi)酰胺酶的分類重要分為典型超廣譜β—內(nèi)酰胺酶和其它類型的超廣譜β—內(nèi)酰胺酶，所謂典型超廣譜β—內(nèi)酰胺酶就是人們最早發(fā)現(xiàn)的TEM型和SHV型，另首先隨即發(fā)現(xiàn)的在CTX—M型酶和PER型酶中這類酶都是高產(chǎn)β—內(nèi)酰胺酶，形成了非常耐藥的菌株。在CRSI的原則更新中，我們能夠注意到，現(xiàn)在CRSI已經(jīng)不推薦在臨床報告中報告BSCR也就是超廣譜β—內(nèi)酰胺酶，由于我們在臨床表型中普通會發(fā)現(xiàn)β—內(nèi)酰胺酶陽性甚至是超廣譜β—內(nèi)酰胺酶陽性的狀況下，部分三代頭孢治療仍然有效，因此，CRSI修訂了全部三代以上頭孢的判斷原則。不管是KD法還是MIC法，這也就意味著在此后的報告中，我們能夠不報告BSCR，而只報告具體的抗菌藥品的解釋成果。但是，BSCR仍然是我們對于耐藥監(jiān)測的重點(diǎn)監(jiān)測內(nèi)容，它能夠有助于我們避免院內(nèi)感染的發(fā)生。除了阿斯菌酶和ESBL酶之外，我們還能夠發(fā)現(xiàn)另外一種酶，如我們左上方這張圖所顯示的，在單獨(dú)加入克拉維酸或者是氯唑西林后，兩種酶都不能將待測菌的酶克制住，但是當(dāng)我們下方同時加入克拉維酸和氯唑西林時，該酶將被克制住。這種表型我們普通稱為超超廣譜β—內(nèi)酰胺酶，也就是SSBLs，但是這種酶型在臨床上并不常見，另外，尚有一種酶型就是我們右下方這張圖所顯示的，即便是我們將克拉維酸和氯唑西林兩種酶克制劑都加入到待測槽中，仍然不能夠?qū)⒋郎y菌產(chǎn)生的酶克制住，而這就闡明，這個菌產(chǎn)生了另外一種β—內(nèi)酰胺酶，普通我們首先想到就是其它的碳青霉烯酶，如金屬酶。下面我們就為大家繼續(xù)介紹另一種重要的β—內(nèi)酰胺酶，碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是指全部能明確水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗菌藥品的一類β內(nèi)酰胺酶。碳青霉烯酶重要分為天然來源的碳青霉烯酶和獲得性的碳青霉烯酶，天然來源的碳青霉烯酶重要由嗜麥芽臨時養(yǎng)單胞菌形成，而獲得型的碳青霉烯酶根據(jù)分子分類普通分為A類酶、B類酶和C類酶。下面我們將以實(shí)例逐個的介紹一下各類酶的檢測以及鑒定。A類酶經(jīng)常分類屬于ⅡF型，含有四氨酸位點(diǎn)，能夠被克拉維酸克制。涉及陰溝腸桿菌、綿質(zhì)沙雷菌，由染色體介導(dǎo)的NMC—A，SMEe酶等等，以及質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC—Ⅰ和KPC—Ⅱ酶，從氯甲單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的GES—Ⅱ酶，A類碳青霉烯酶都是青霉素酶，對亞胺培南的水解活性強(qiáng)于美羅培南，能夠引發(fā)青霉素類、氨曲能，碳青霉烯類抗菌藥品的耐藥。B類酶就是我們普通所說的金屬酶，這張圖片就顯示的金屬酶的測定，金屬酶分類屬于Ⅲ型，金屬酶不僅對β—內(nèi)酰胺酶的克制劑敏感性差，并且能夠水解涉及碳青霉烯酶在內(nèi)的幾乎全部的β—內(nèi)酰胺類的抗菌藥品。金屬酶分類屬于Ⅲ類酶，多數(shù)金屬酶對亞胺培南的水解能力強(qiáng)于美羅培南，但蠟樣芽孢桿菌Ⅱ酶和ⅢD中的ASDL—1對美羅培南的水解能力更強(qiáng)。金屬酶對氨曲能的水解能力都非常弱。最后一類碳青霉烯酶是C類酶，也就是我們普通所說的OSA系列酶。在布氏分群中屬于ⅡB類，OSA型碳青霉烯酶對亞胺培南的水解活性很低，對頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲能水解活性也很弱，除OXA—23外，其它酶能被克拉維酸所克制。OXA碳青霉烯酶基因可位于質(zhì)?；蛉旧w上，或者定位于Ⅰ型整合體的基因盒中。含有向其它菌種轉(zhuǎn)移的能力。我們回到金屬酶的測定，首先我們看到左邊是屬于一種典型的金屬酶測定的test條，上方是單劑亞胺培南，下方是亞胺培南加EDTA，當(dāng)它們兩個讀數(shù)相差3個劑試度也就是三倍時，顯示金屬酶檢測陽性，如果實(shí)驗(yàn)室沒有這種金屬酶測試條，我們能夠通過更簡樸的辦法，也就是說紙片測定法，在紙片測定法中我們要注意，普通我們選擇的是亞胺培南紙片進(jìn)行測定，上面這張亞胺培南是Ⅲ劑亞胺培南，下面這張亞胺培南是加了EDPA的亞胺培南，當(dāng)兩者的直徑不不大于5毫米時，顯示金屬酶測定為陽性。另一種碳青霉烯酶稱作A類酶，典型代表是我們近來經(jīng)常聽到的KT金萬酶。檢測KP菌酶最典型的辦法在CRSI的原則測定上會給大家介紹。首先我們注意右邊的這幅圖，在平皿中均勻以涂布0.5個麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希原則菌株ATCC25922，在碟子正中間貼一種10微克含量的亞胺培南，此時我們不再挖槽，而將待測菌從遠(yuǎn)端向，從紙片外緣向平皿邊沿劃線，劃好線后，我們將平皿放入35度培養(yǎng)過夜。在判讀成果時，亞胺培南在抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待測菌矢狀生長者為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。例如我們看到的左側(cè)和右側(cè)兩個待測點(diǎn)都是高度懷疑產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株。此時，我們不能夠就報KPC酶陽性，而應(yīng)當(dāng)通過PCR擴(kuò)增的辦法或者是DNA測序的辦法來證明，終究是產(chǎn)的哪一種KPC酶。這是我們臨床分離中檢測的成果，我們看一下臨床測試中10號組產(chǎn)生的KPC酶0度不不大于12號菌和8號菌，而6號菌，而16號菌和9號菌則能夠認(rèn)為是不產(chǎn)KPC酶。另一類碳青霉烯酶是OXA—23，OXA—23在孢曼不動桿菌中經(jīng)常被檢出，這類文章也非常得多。OXA—23的檢測就是我們在之前講到的既不被克拉維酸克制，既不單獨(dú)被克拉維酸克制也不單獨(dú)被氯唑西林克制，而兩種克制劑加在一起仍不被克制的菌型時，我們就要通過PCR的辦法來檢測OXA酶，這一張PCR圖是我們在檢測孢曼不動桿菌時的一張PCR電影，我們能夠看到1號菌和2號菌在攝影中產(chǎn)生的是IPM型酶，而20號和33號我們放入的引物是PER酶，只有33號的PER酶擴(kuò)增為陽性，15號和18號產(chǎn)生的是OXA23型酶，OXA23型酶產(chǎn)量是非常高的，一旦孢曼不動桿菌獲得了OXA23酶的這個基因，或者是它的基因有所體現(xiàn)，此時，它的耐藥性是非常高的。好，這就是我們剛剛所說的，右下方的這個其它陽性圖就是我們高度懷疑產(chǎn)生碳青霉烯酶的菌株，此時如果我們實(shí)驗(yàn)室有條件有應(yīng)當(dāng)開展kpc酶、OXA23型酶以及其它碳青霉烯酶的檢測。以上所講的就是重要的革蘭陰性桿菌中β內(nèi)—酰胺酶的酶型以及簡要的檢測辦法，下面我們再給大家簡要介紹一下氨基糖苷類鈍化酶。氨基糖苷類藥品耐藥的機(jī)制，重要是細(xì)菌將氨基糖苷類抗菌藥品進(jìn)行了鈍化，首先它能夠?qū)⑦@類抗菌藥品通過下列幾個酶進(jìn)行鈍化，這三種酶重要有磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶。三者分別使抗菌藥品羥基磷酸化、氨基乙?；土u基核苷化，使之不能再與細(xì)菌核糖體結(jié)合，因此，形成了氨基糖苷類藥品的耐藥。另外，我還要向大家介紹一種氨基糖苷類耐藥的另一種機(jī)制，我們注意一下第二個乙酰轉(zhuǎn)移酶。在我們對我院的孢曼不動桿菌整合進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，有30%的菌株產(chǎn)生Ⅰ型整合酶。這兩張圖片顯示的是整合酶的檢測和檢出。當(dāng)我們將整合子進(jìn)行全序列測序時發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型整合子中包含著氨基糖苷類鈍化酶，也就是乙酰轉(zhuǎn)移酶的序列，因此，氨基糖苷類藥品的耐藥也和Ⅰ型整合子存在著相稱親密的關(guān)系，這一點(diǎn)值得大家注意。在產(chǎn)酶機(jī)制中喹諾酮類的DNA轉(zhuǎn)移酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的變化也是另一種重要的酶型變化的機(jī)制。喹諾酮類靶位親和力的減少使得細(xì)菌對喹諾酮類的耐藥性增加。有關(guān)基因的突變可使DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的氨基酸序列發(fā)生變化，從而造成喹諾酮的高水平耐藥。而這只是喹諾酮耐藥的一種機(jī)制之一，喹諾酮類藥品的耐藥機(jī)制另一種重要因素是膜孔蛋白的變化及外排系統(tǒng)覆蓋，下面我們就以喹諾酮類藥品為重要代表，介紹一下膜孔蛋白的變化及外排系統(tǒng)。膜孔蛋白的變化及細(xì)胞膜通透性變化，它是革蘭陰性桿菌的另一種重要的耐藥機(jī)制。細(xì)胞外膜上的某些特殊蛋白是一種非特異性、跨越細(xì)胞膜的水溶性物質(zhì)擴(kuò)散通道，稱為膜孔蛋白。膜孔蛋白是喹諾酮類抗菌藥品進(jìn)入外膜的重要通道。例如，銅綠假單胞菌的細(xì)胞外膜上沒有大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌所含有的典型的高滲入性孔蛋白，它的孔蛋白通道對小分子物質(zhì)的滲入速度僅為典型孔蛋白通道的1%。亞胺培南是一種非典型性的β—內(nèi)酰胺類抗菌藥品，其對銅綠假單胞菌的活性重要是通過一種特殊的孔蛋白通道，OprD2的擴(kuò)散而實(shí)現(xiàn)的，一旦這一孔蛋白通道消失，則銅綠假單胞菌對亞胺培南會產(chǎn)生耐藥。這張圖片顯示的是膜孔蛋白，我們看右上角紅色區(qū)域就是一種正常的膜孔蛋白，而碳青霉烯類藥品亞胺培南及美羅培南正是通過這個膜孔蛋白