離子交換層析

第九章離子交換層析及凝膠過濾介質(zhì)1整理課件一、根本原理離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基因以共價(jià)鍵連接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反響主要以離子交換方式進(jìn)行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反響，反響式為：RA++B+RB++A+離子交換層析離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。此法廣泛應(yīng)用于很多生化物質(zhì)(例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機(jī)酸等)的分析、制備、純化，以及溶液的中和、脫色等方面。2整理課件離子交換色譜中所進(jìn)行的離子交換過程〔以陽離子交換樹脂為例〕3整理課件離子交換劑對(duì)溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強(qiáng)酸性(陽性)離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力比對(duì)Na+的??；強(qiáng)堿性(陰性)離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力比對(duì)Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力遠(yuǎn)比對(duì)Na+的大；弱堿性離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力比對(duì)Cl-的大。因此，在應(yīng)用離子交換劑時(shí)，采用何種反離子進(jìn)行電荷平衡是決定吸附容量的重要因子之一。離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間電荷相同時(shí)，那么離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結(jié)合力亦越大。4整理課件

兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH低于等電點(diǎn)(pI)時(shí)，它們帶正電荷能與陽離子交換劑結(jié)合；反之，pH高于pI時(shí)，它們帶負(fù)電荷能與陰離子交換劑結(jié)合。pH與pI的差值越大，帶電量越大，與交換劑的結(jié)合力越強(qiáng)。離子交換層析之所以能成功地把各種無機(jī)離子、有機(jī)離子或生物大分子物質(zhì)分開，其主要依據(jù)是離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力。

5整理課件6整理課件氨基酸的離子交換別離原理7整理課件Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead8整理課件Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----9整理課件Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--10整理課件Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++11整理課件Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------12整理課件1．上樣階段，此時(shí)離子交換劑與平衡離子結(jié)合；〔平衡階段〕2．吸附階段，混合樣品中的分子與離子交換劑結(jié)合；3．開始解吸階段，雜質(zhì)分子與離子交換劑之間結(jié)合較弱而先被洗脫，目標(biāo)分子仍處于吸附狀態(tài)；4．完全解吸階段，目標(biāo)分子被洗脫；5．再生階段，用起始緩沖液重新平衡層析柱，以備下次使用。離子交換層析一般步驟13整理課件氨基酸的別離過程14整理課件二、離子交換劑的局部性質(zhì)㈠粒度基質(zhì)顆粒大小直接關(guān)系到別離效果，顆粒越小，層析柱的理論塔板數(shù)就越大，別離效果越好，但同時(shí)交換容量變小，層析時(shí)背景壓力增大，限制了流速的提高，因此細(xì)顆粒的介質(zhì)常適用于分析型別離；相反，基質(zhì)顆粒越大，柱效率會(huì)下降，但離子交換劑的交換容量提高，背景壓力減小，因此大顆粒介質(zhì)適合于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模別離及大規(guī)模工業(yè)化別離。15整理課件㈡交聯(lián)度和網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)交聯(lián)度的大小影響著離子交換劑的很多特性，包括機(jī)械強(qiáng)度、膨脹度、網(wǎng)孔大小、交換容量等。一般交聯(lián)度越高，網(wǎng)孔的孔徑越小；交聯(lián)度越低，網(wǎng)孔孔徑越大。僅瓊脂糖交換劑是例外.16整理課件㈡交聯(lián)度和網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)別離介質(zhì)的孔有3種結(jié)構(gòu)。第一種通過交聯(lián)使大分子鏈間形成孔，這叫凝膠孔。第二種在有溶劑存在條件下進(jìn)行聚合，稱為大孔樹脂。第三種為瓊脂糖介質(zhì)的孔，孔徑大小僅與瓊脂糖濃度有關(guān)，交聯(lián)對(duì)孔結(jié)構(gòu)影響不大。17整理課件㈢電荷密度電荷密度是指基質(zhì)顆粒上單位外表積的取代基〔功能集團(tuán)〕的數(shù)量，它決定著離子交換劑的交換容量、膨脹度等性質(zhì)。對(duì)小分子進(jìn)行離子交換時(shí)，交換劑上功能基團(tuán)密度越大，工作能力越強(qiáng)，高電荷密度的離子交換劑具有優(yōu)勢(shì)。18整理課件㈣膨脹度又稱吸水值，是指當(dāng)干態(tài)的離子交換劑在水溶液中吸水后造成體積膨脹的程度，通常用每克干膠吸水膨脹后的體積〔毫升〕來表示。19整理課件㈤交換容量交換容量是指離子交換劑能夠結(jié)合溶液中可交換離子的能力，通常分為總交換容量和有效交換容量?？偨粨Q容量用每克干介質(zhì)或每毫升濕膠包含的帶電功能基團(tuán)的數(shù)量來表示.可以通過酸堿滴定的方法來測(cè)定，也可使得離子交換劑和某種小的離子之間發(fā)生完全交換，然后通過測(cè)定該離子的含量算出總交換容量，總交換容量并不反映交換劑對(duì)可交換分子的結(jié)合情況.20整理課件有效交換容量指每克干介質(zhì)或每毫升濕膠在一定的實(shí)驗(yàn)條件下吸附某種分子的實(shí)際容量。由于有效容量是一個(gè)變值，在說明其數(shù)值時(shí)應(yīng)當(dāng)同時(shí)指出實(shí)驗(yàn)條件.一般情況下，同一種交換劑對(duì)于分子量小的蛋白質(zhì)有效交換容量較大，而對(duì)于分子量大的蛋白質(zhì)有效容量較小；對(duì)于同一種蛋白質(zhì)，離子交換劑的交聯(lián)度越小有效容量越大，而交聯(lián)度越大有效容量越小。21整理課件二、離子交換劑離子交換劑應(yīng)滿足的根本條件有：①有高度的不溶性。即在各種溶劑中不發(fā)生溶解；②有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的外表積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換；③有較多的交換基團(tuán)；④有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。在使用過程中，不因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。22整理課件(一)離子交換劑的種類根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)，可將其分成兩大類：1.疏水性離子交換劑疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂。常用的樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑，能把聚乙烯苯直鏈化合物連接成類似海綿狀的結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中以共價(jià)鍵引入不同的電荷基團(tuán)。離子交換樹脂以電荷基團(tuán)的性質(zhì)分那么有：陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂(分別包括強(qiáng)、中、弱三種電荷基團(tuán))和螯合離子交換樹脂(對(duì)金屬離子有較強(qiáng)的選擇性)。23整理課件(1)陽離子交換劑陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。因此，可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反響。根據(jù)電荷基團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將陽離子交換劑分為強(qiáng)酸型(帶磺酸基團(tuán))、中強(qiáng)酸型(帶磷酸基團(tuán)或亞磷酸基團(tuán))和弱酸型(帶羧基的或酚基)三種。(2)陰離子交換劑陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺〔-N(CH3)3〕、叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔-NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基團(tuán)構(gòu)成的。當(dāng)引入季胺和叔胺基團(tuán)時(shí)，分別為強(qiáng)陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑。當(dāng)引入仲胺和伯胺基團(tuán)時(shí)，為弱陰性離子交換劑。24整理課件樹脂型離子交換劑一般都呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的珠狀體，其大小在20-50目之間。近年Bio-Rad公司還制造了50-100目、100-200目以及200-400目的產(chǎn)品，目數(shù)大的樹脂對(duì)提高分辨率和交換容量是有利的。疏水性的離子交換劑由于含有大量的活性基團(tuán)，交換容量高、機(jī)械強(qiáng)度大、流動(dòng)速度快。因此，主要用于別離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質(zhì)，其次可用于從蛋白質(zhì)溶液中除去外表活性劑(如十二烷基硫酸鈉)、清潔劑(如tritonX-100)、尿素、兩性電解質(zhì)(Ampholyte)。此外，還可用于別離某些不易變性的蛋白質(zhì)。25整理課件疏水性的離子交換劑對(duì)帶電荷多和疏水性強(qiáng)的被別離物有較強(qiáng)的截留能力。陽離子交換樹脂對(duì)氨基酸的別離26整理課件2.親水性離子交換劑這類交換劑與水的親和力較大，載體孔徑大，適合于別離生物大分子，有多種類型：(1)纖維素離子交換型以纖維素為基質(zhì)，常用的功能基因有磷酸基(P.中強(qiáng)酸型)、磺酸乙基(SE，強(qiáng)酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，強(qiáng)堿型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱堿型)、氨基乙基(AE，中等堿型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等堿型)等，可制成纖維狀、微粒、短纖維、球形四種類型，Pharmacia(GE)公司生產(chǎn)的DEAE-Sephacel為球形顆粒，機(jī)械性能和理化穩(wěn)定性好，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交換容量，使用簡(jiǎn)單方便，在生物化學(xué)與分子生物學(xué)中使用普遍。此外，Watman公司的DE-、CM-、P-、AE-、SE-及QA-纖維素，Bio-Rad公司的CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些國產(chǎn)的DEAE-纖維素和CM-纖維素也可選擇使用。27整理課件(2)葡聚糖系離子交換劑

以SephadexG25和G50為基質(zhì)，分別引入DEAE、QAE(二乙基(二羧丙基)氨基乙基，弱堿型)、CM、SP(磺丙基、強(qiáng)酸型)等功能基因，構(gòu)成8種交換劑，交換容量較離子交換纖維素大，除離子交換作用外，還有分子篩作用，但層析時(shí)床體積隨洗脫劑離子強(qiáng)度的增加而縮小，以SephadexG50為基質(zhì)的交換劑尤其明顯，為使用帶來不便。

28整理課件(3)瓊脂糖系列離子交換劑：以瓊脂糖為基質(zhì)，主要有Pharmacia(GE)公司的Sepharose和Bio-Rad公司的Bio-gel兩個(gè)系列。①Sepharose系列離子交換劑：早期產(chǎn)品為DEAE-SepharoseCL-6B和CM-SepharoseCL-6B，對(duì)生物大分子分辨力好，交換容量大，床體積隨洗脫液的離子強(qiáng)度和pH的改變小，使用較Sephadex系列方便。后續(xù)產(chǎn)品SepharoseFastFlow(SepharoseFF)理化穩(wěn)定性和機(jī)械性能更好。交換容量大，可以在床清洗，床體積隨pH的離子強(qiáng)度變化很小，由于流速和載量高，適合于進(jìn)行大量粗產(chǎn)品的純化工作。引入的功能機(jī)團(tuán)有Q(強(qiáng)堿性)、SP、DEAE、CM四種。此外，SepharoseHighPerformnce(SepharoseHP)有Q-SepharoseHP和SP-SepharoseHP兩種，顆粒細(xì)、分辨率高，理化穩(wěn)定性好，流速和載量均適合于實(shí)驗(yàn)室或大量制備使用。②Bio-GelA系離子交換劑：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA兩種，回收率極高，床體積隨pH和離子強(qiáng)度變化小，pH和化學(xué)穩(wěn)定性好。29整理課件(4)Source系列離子交換劑有Q(強(qiáng)堿型的)和S(強(qiáng)酸型)兩種，是低壓層析系統(tǒng)中分辨率最高，流速最快的離子交換劑，理化穩(wěn)定性極好，可用1mol/LHCl和1mol/LNaOH在床清洗，使用壽命長(zhǎng)，樣品回收率高，重復(fù)性好，工藝放大容易。(5)MonoBeads系列離子交換劑是Pharmacia(GE)公司推出的新型交換劑，以親水性聚醚為基質(zhì)，能快速別離蛋白質(zhì)，肽和低聚核苷酸，動(dòng)態(tài)載樣量大，可別離從mg到g的單克隆抗體。30整理課件(二)離子交換劑的選擇任何一種離子交換劑都不可能適用于別離所有的樣品。因此，選擇理想的離子交換劑是提高有效成分的得率和分辨率的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。1.陰、陽離子交換劑的選擇如果被別離物質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被別離物質(zhì)帶負(fù)電荷，那么應(yīng)選擇陰離子交換劑；如果被別離物質(zhì)為兩性離子，要按照其穩(wěn)定狀態(tài)的凈電荷來選擇交換劑。假設(shè)一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5，假設(shè)該物質(zhì)在pH5-8穩(wěn)定時(shí)，應(yīng)選擇陰離子交換劑；假設(shè)該物質(zhì)在pH5以下穩(wěn)定時(shí)，那么可選擇陽離子交換劑。2.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇一般來說，強(qiáng)離子交換劑適用的pH范圍很廣。所以常用它來制備無離子水和別離一些在極端pH溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。而弱性離子交換劑適用的pH范圍較窄，在pH為中性的溶液中交換容量也高，用于別離生物大分子物質(zhì)時(shí)，其活性不易喪失。所以，別離生物樣品多采用弱離子交換劑。31整理課件3.反離子的選擇離子交換劑處于電中性時(shí)往往帶有一定的反離子。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。所此，強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。4.基質(zhì)的選擇樹脂基質(zhì)是疏水性化合物，而纖維素、葡聚糖和瓊脂糖基質(zhì)那么是親水性化合物。在別離生物大分子時(shí)，親水性基質(zhì)交換容量高，且對(duì)生物大分子物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，被別離物質(zhì)活性不易受到破壞。要恰當(dāng)?shù)剡x擇離子交換劑，必須對(duì)被別離物的性質(zhì)和所處溶液組分及酸堿度等因素進(jìn)行全面分析。綜合考慮上述4個(gè)方面，選擇的離子交換劑才能成功地別離樣品。32整理課件三、操作1.離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型取適量的固體離子交換劑先用水浸泡，待充分膨脹后加大量的水懸浮除去細(xì)顆粒，此后改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)和使其帶上需要的反離子。疏水性離子交換劑可以用2-4倍的2mol/LNaOH或2mol/LHCl溶液處理；而親水性離子交換劑那么只能用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理(室溫下處理30分鐘)。酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。在每次用酸(或堿)處理后，均應(yīng)先用水洗滌至近中性，再用堿(或酸)處理。末了用水洗滌至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可使用或裝柱。33整理課件使用過的離子交換劑，可采用一定的方法使其恢復(fù)原來的性狀，這一過程叫做再生。再生可以通過上述的酸、堿反復(fù)處理完成，但有時(shí)也可以通過轉(zhuǎn)型處理完成。所謂轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)為另一種反離子的過程。比方，欲使陽離子交換劑轉(zhuǎn)成鈉型時(shí)，那么需用NaOH處理；欲使其轉(zhuǎn)成氫型時(shí)，那么需用HCl處理；欲使其帶銨離子時(shí)，那么需用NH4OH或NH4Cl處理。長(zhǎng)期使用過的樹脂含有很多雜質(zhì)，欲將其除掉，應(yīng)先用沸水處理，然后用酸、堿處理。用熱的稀酸、稀堿處理效果更好。樹脂假設(shè)含有脂溶性雜質(zhì)時(shí)，可用乙醇或丙酮處理。而長(zhǎng)期使用過的親水性離子交換劑的處理一般只用酸、堿浸泡即可。原那么上講，去除雜質(zhì)的過程應(yīng)在不破壞離子交換劑的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，不影響其原有交換容量的前提下進(jìn)行。34整理課件2.緩沖液的選擇離子交換劑不僅可以與被別離物進(jìn)行交換，而且還可以與緩沖液中的離子進(jìn)行交換。因此，離子交換劑吸附被別離物的量與緩沖液的pH值和離子濃度有密切關(guān)系。起始緩沖液pH值和離子強(qiáng)度要能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，而雜質(zhì)與交換劑不結(jié)合，那么pH值一般比有效成分的pI高一個(gè)單位(用陰離子交換劑)或低一個(gè)單位(用陽離子交換劑)，離子強(qiáng)度為0.1時(shí)，就可很快地把有效成分與雜質(zhì)分開?；蛘哌x擇起始緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值，使有效成分與離子交換劑結(jié)合得不牢固，而雜質(zhì)與離子交換劑結(jié)合得牢固，也能得到高純度有效成分。選用的洗脫液，其離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)度要比起始緩沖液高，pH值要按離子交換劑性質(zhì)來選擇。35整理課件3.被別離物質(zhì)的交換使用離子交換劑的方法有兩種：一種是柱層析法，也叫動(dòng)態(tài)法，即將離子交換劑裝入層析柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過。該法交換效率高，應(yīng)用范圍廣；另一種是分批法，也叫靜態(tài)法，即將離子交換劑置入盛溶液的容器內(nèi)緩慢地?cái)嚢?。該法交換率低，不能連續(xù)進(jìn)行，但是，需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易。柱層析法裝柱的操作和要求與吸附柱層析相同。離子交換劑的總用量要依據(jù)其交換容量和待吸附物質(zhì)的總量(包括連續(xù)使用的全部量)來計(jì)算。當(dāng)溶液含有各種雜質(zhì)時(shí)，必須考慮使交換量留有充分余地，實(shí)際交換量只能按理論交換量的25%-50%計(jì)算。在樣品純度極低，或有效成分與雜質(zhì)的性質(zhì)相似時(shí)，那么實(shí)際交換量應(yīng)控制得更低些。層析柱高與直徑比例一般要大于10∶1，別離樣品的成分復(fù)雜時(shí)，比例宜高一些，用于樣品濃縮和脫鹽時(shí)，比例可低一些。36整理課件4.被別離物質(zhì)的洗脫與收集在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度那么是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。梯度溶液按組成來分，一般有二種：一種是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液。是用一簡(jiǎn)單的鹽(如NaCl或KCl)溶解于稀緩沖液制成的，習(xí)慣上不用弱酸或弱堿的鹽類；另一種是改變pH值的梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量的緩沖液制成的，所用緩沖液的種類、pH值以及緩沖容量要認(rèn)真選擇，否那么將達(dá)不到預(yù)期目的。對(duì)于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大局部是增加的。而改變pH值的梯度溶液那么不然，如果使用的是陽離子交換劑，pH值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，