黃瓜葉片抗氧化酶活性對低溫脅迫的響應(yīng)

黃瓜葉片抗氧化酶活性對低溫脅迫的響應(yīng)

黃瓜是我國重要的蔬菜品種。然而，由于其對低溫的敏感特點，植物在冬季面臨0.15c的低溫破壞，失去正常的生理功能，并在生產(chǎn)效率中損失。目前解決這個問題的辦法只有培育耐冷品種和利用加溫設(shè)備,但采用加溫措施一方面增加生產(chǎn)成本,另一方面對環(huán)境造成污染。因此,解決這個問題最根本的途徑就是選育耐冷的設(shè)施專用黃瓜品種。黃瓜耐冷新品種的選育有賴于其耐性機制的最終闡明,而低溫下活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)積累是植物產(chǎn)生冷害的重要方面。ROS是植物體內(nèi)代謝活動的副產(chǎn)物,在正常的生理狀態(tài)下,它們可以被植物本身的抗氧化系統(tǒng)清除,從而在其產(chǎn)生與清除之間建立起一種動態(tài)平衡。當(dāng)植物遇到低溫等逆境脅迫時,ROS的產(chǎn)生速度大大提高而清除能力受到抑制,結(jié)果這種平衡被打破,造成ROS大量積累。因此,如何有效地清除過量產(chǎn)生的ROS并保持其含量的平衡是植物能否順利度過低溫逆境的關(guān)鍵。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和過氧化物酶(peroxidase,POD)是植物體內(nèi)主要的ROS酶促清除系統(tǒng),前人已經(jīng)比較了常溫和低溫脅迫下黃瓜葉片的抗氧化酶活性的差異,但有關(guān)整個冷害過程中黃瓜葉片抗氧化酶活性的動態(tài)變化還未見報道。因此,本實驗以SOD、CAT和POD這3種抗氧化酶為對象,利用田間自然低溫對其活性的動態(tài)變化進行了研究,以期揭示冷害過程中黃瓜葉片抗氧化酶活性的變化規(guī)律,為進一步研究黃瓜的耐冷機理提供參考。1材料和方法1.1試驗1:34片真葉制備試驗材料為津研4號(C.sativusL.cv.JinyanNo.4)、津綠3號(C.sativusL.cv.JinlüNo.3)和津優(yōu)10號(C.sativusL.cv.JinyouNo.10),其中津研4號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供,津綠3號和津優(yōu)10號購于南京市星光種子公司。采用營養(yǎng)缽葦末基質(zhì)育苗,3~4片真葉時(2003年4月15日)定植于露地,4月21日~25日遇到了連續(xù)的陰雨低溫天氣(夜間最低氣溫約6℃,白天最高氣溫約13℃),26日放晴(夜間最低氣溫約18℃,白天最高氣溫約28℃)。本試驗于4月24日采樣作為低溫脅迫時處理,26日作為脅迫后處理,5月1日作為恢復(fù)期處理。每個處理4~5株混合采樣,采樣部位為剛展開的新葉。葉片剪碎并充分混勻后平行取3份進行酶活性測定。1.2超氧化物歧化酶sod活性測定黃瓜材料低溫下受害程度的測定:按Semeniuk的方法在天氣放晴后(2003年4月26日)對黃瓜葉片的冷害癥狀進行分級。0級:無受害癥狀;1級:葉片輕微受害,葉緣發(fā)黃;2級:葉片有小面積出現(xiàn)脫水斑;3級:葉片約有一半的面積出現(xiàn)脫水斑;4級:葉片大面積出現(xiàn)脫水斑;5級:葉片幾乎全部干枯。按以下公式計算冷害指數(shù):冷害指數(shù)=(1×S1+2×S2+3×S3+4×S4+5×S5)/N式中S1~S5分別等于1~5級癥狀的處理株數(shù),N等于總的處理株數(shù)。酶液的提取按陳勁楓等的方法:稱取0.2g樣品,加入3倍體積的預(yù)冷提取液(0.1mol·L-1Tris-HCl緩沖液,pH7.5,含0.5%巰基乙醇,用前加),冰浴研磨至勻漿,4000r·min-14℃下離心15min,上清液保存于-70℃冰箱備用。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參考李合生的方法,以抑制NBT光化學(xué)還原的50%為1U。過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法:在玻璃比色皿中依次加入2mL0.1mol·L-1的醋酸緩沖液(pH5.4)、1mL0.25%的愈創(chuàng)木酚溶液、0.05mL酶液、0.1mL0.75%H2O2溶液,迅速顛倒混勻后立即比色,每隔30s讀取A460值,共3min,以每分鐘A460上升1為1U。過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外分光光度計法:在玻璃比色杯皿中依次加入3mLCAT反應(yīng)液(0.05mol·L-1磷酸緩沖液,pH7.0,內(nèi)含15mmol·L-1H2O2)、0.05mL酶液,迅速顛倒混勻后立即比色,每隔30s讀取A240值,共3min,以A240每分鐘下降1為1U。2結(jié)果與分析2.1水漬狀斑的形成在低溫脅迫過程中,黃瓜功能葉片的主要冷害癥狀是邊緣黃化并輕微卷曲、出現(xiàn)水漬狀斑點,嚴(yán)重的水漬狀斑點連成大片;新生葉片則在葉面出現(xiàn)大量褪綠斑并皺縮。天晴后,水漬斑變成干枯斑甚至穿孔。耐冷力不同的黃瓜材料在低溫脅迫下的受害程度不同,其中津研4號表現(xiàn)出較高的冷害指數(shù),津綠3號表現(xiàn)中等,津優(yōu)10號則表現(xiàn)出較強的耐冷力(表1)。2.2黃瓜葉片的氧化酶活性變化2.2.1種菌株對cat活性的影響從圖1,A可以看出,在低溫脅迫期間,CAT活性大小與黃瓜葉片的耐冷力表現(xiàn)一致。脅迫后3個品種的CAT活性都受到抑制,但津優(yōu)10號的CAT活性仍顯著高于其它2個品種。在恢復(fù)期間,津研4號和津綠3號的CAT活性上升而津優(yōu)10號下降,此時,CAT的活性大小表現(xiàn)為與黃瓜材料的耐冷力相反。2.2.2pod的活性低溫脅迫時的POD活性與黃瓜品種的耐冷力一致。脅迫后3個品種的POD活性均受到抑制,但品種間無明顯差異?；謴?fù)期,3個品種的POD活性都上升,但津研4號的升幅達2462%,顯著高于津綠3號的79%和津優(yōu)10號的338%(圖1,B)。2.2.3個品種、3個品種、3個品種的sod活性變化低溫脅迫時葉片SOD的活性大小與黃瓜品種的耐冷力高低表現(xiàn)出相反的趨勢;脅迫后3個品種的SOD活性都下降,3個品種的下降幅度分別為津優(yōu)10號8.016%、津綠3號10.32%、津研4號62.57%;恢復(fù)正常后,3個品種的SOD活性繼續(xù)下降,但品種之間無顯著差異(圖1,C)。3低溫脅迫和生理對植物抗氧化酶活性的影響Lee等人認(rèn)為SOD活性的增加會引起H2O2(過氧化氫)的積累,津優(yōu)10號在低溫脅迫時具有較低的SOD活性和較高的CAT、POD活性,既防止了H2O2的積累,又避免了O??22-?(超氧陰離子)和H2O2反應(yīng)生成毒性更強的羥基自由基,從而減輕了ROS對植株的傷害,因為迄今在植物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)羥基自由基的清除劑。低溫脅迫后3個黃瓜品種的CAT、POD、SOD活性都受到抑制,也說明了脅迫后的環(huán)境條件對植物的傷害更大。Hariyadi和Parkin也認(rèn)為膜脂的過氧化出現(xiàn)在低溫脅迫后的恢復(fù)期而不是低溫脅迫期間。Lee等人研究發(fā)現(xiàn),盡管低溫脅迫期間H2O2含量增加,但脅迫后24h的H2O2仍要顯著高于脅迫期間,這也就造成了脅迫后葉片的冷害癥狀由水漬斑變?yōu)楦煽?。但脅迫后津優(yōu)10號的CAT活性顯著高于其它2個品種,說明津優(yōu)10號具有較強的活性氧清除能力,這也是津優(yōu)10號冷害指數(shù)低于其它2個品種的主要原因。另外,脅迫后津優(yōu)10號的SOD和POD活性與津研4號相比均無明顯差異,這說明CAT在黃瓜葉片的耐冷機制中起著更重要的作用。龔吉蕊等發(fā)現(xiàn)隨著脅迫加劇,抗水分脅迫較弱的植物具有較低的POD活性,他們認(rèn)為這與POD能催化ROS產(chǎn)生有關(guān)。本試驗中,耐冷力最弱的津研4號的POD活性在恢復(fù)期上升幅度最大,也可能與此有關(guān)。另外,在此階段,津研4號和津綠3號的CAT活性都上