小鼠體內(nèi)多肽k

小鼠體內(nèi)多肽k

腫瘤的持續(xù)生長和入侵轉(zhuǎn)移與腫瘤新血管的形成密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是作用最強(qiáng)的促血管生成因子,通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體-2(VEGFR-2,又稱KDR)結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,引發(fā)新生血管生成。KDR主要表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和胚胎血管內(nèi)皮細(xì)胞。從噬菌體多肽庫中篩選而獲得的12肽K237,可高親和力特異性結(jié)合KDR,阻斷VEGF與KDR的結(jié)合,阻止新生血管生成,切斷腫瘤營養(yǎng),達(dá)到治療腫瘤的目的。本研究采用99mTc直接標(biāo)記人工合成的多肽K237,探討99mTc-K237的最佳標(biāo)記條件及其在動物體內(nèi)的分布。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物與儀器清潔級昆明小鼠及BALB/c裸鼠購于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;K237委托上海華大天源生物科技有限公司合成;SnCl2·2H2O由Merck公司生產(chǎn);99mTcO-4洗脫液由上海欣科醫(yī)藥公司提供;人奇靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)引自美國培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。實(shí)驗(yàn)儀器:SN-695B型智能放免γ測量儀(上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠);FA2104N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);Delta320pH計(上海梅特勒-托利多公司);FG-391A2型微機(jī)活度計(北京核儀器廠);高效液相色譜儀(HPLC,島津公司);BSZ-100自動收集儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。1.29snpl22h2o及k3采用直接標(biāo)記法,對影響標(biāo)記結(jié)果的5個重要因素分別選取不同的水平:SnCl2·2H2O用量20～160μg;K237用量40～140μg;反應(yīng)體系的pH值2.0～11.0;反應(yīng)溫度4～37℃;反應(yīng)時間10～30min。1.3mtc-納米金屬的rf采用紙層析法,在2種展開體系中進(jìn)行分析。體系1采用新華1號層析紙作為固定相,以丙酮為展開劑,99mTc-K237及膠體的Rf=0,99mTcO-4的Rf=0.7～0.9;體系2以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%牛人血白蛋白浸泡過的新華1號層析紙作為固定相,以V(乙醇)∶V(氨水)∶V(水)=2∶1∶5作為展開劑,99mTc-膠體Rf=0,99mTc-K237及99mTcO-4的Rf=0.7～0.9。1.4k3的吸光度LC-6AD泵;VenusiMRC-ODSC18柱(4.6×250mm),柱溫25℃;流動相A液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸,B液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的乙腈;99mTc-K237進(jìn)樣量50μl,泵流速1.0ml/min;K237標(biāo)準(zhǔn)品和99mTc-K237在214nm處吸光度(A)值最高。用自動部分收集儀收集99mTc-K237洗脫液(每管1ml),流速1ml/min,并測量各管放射性計數(shù),得出洗脫曲線。1.5樣品的采集和放化純的測定取10管200μl的99mTc-K237混懸液,分為2組,用2倍體積的生理鹽水和正常人血清稀釋,分別于室溫和37℃條件下保存24h,并于1、2、6、12及24h取少量樣品測定放化純。1.6特異性細(xì)胞結(jié)合率HUVEC用含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞繁殖至對數(shù)生長期,制成細(xì)胞數(shù)分別為1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個/L的細(xì)胞懸液,各取60μl加入離心管,設(shè)3支復(fù)管,再加入20μl(5.55kBq)標(biāo)記物。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育1h后,測各管總放射性計數(shù)(T)。4℃離心(離心半徑12cm,2000r/min,5min)后去上清,用PBS(0.01mol/L,pH值7.4)洗滌2次,再測結(jié)合在細(xì)胞上的放射性計數(shù)(B)。同時做非特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn),方法同上,不同的是在各管細(xì)胞中先加入50μg未標(biāo)記的K237,再加入等量標(biāo)記物。特異性細(xì)胞結(jié)合率(%)=總細(xì)胞結(jié)合率(B/T)均數(shù)-非特異性細(xì)胞結(jié)合率均數(shù)。99mTcO-4的細(xì)胞結(jié)合率測定:在細(xì)胞懸液中加入20μl(5.55kBq)99mTcO-4洗脫液,其余步驟同上。1.7各組患者單次給藥及密度健康雄性昆明小鼠30只,4～6周齡,體重19～21g,隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組,每組5只。尾靜脈注射2.96MBq(0.1ml)99mTc-K237,分別于注射后30min和1、2、4、8及24h各處死一組小鼠,取血液及其他主要臟器,稱重并測定放射性計數(shù),經(jīng)放射性衰變校正后計算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。1.8大鼠《針》的生長人肺癌A549細(xì)胞于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)傳代。取4～5周齡BALB/c裸鼠3只,體重19～21g,于右前肢腋下接種A549細(xì)胞2×106/只,并飼養(yǎng)于無特殊病原體級動物房,待腫瘤直徑達(dá)1.0cm左右時用于顯像。經(jīng)尾靜脈注射99mTc-K2375.55MBq/只(0.2ml),注射后1、2、3、5及8h行SPECT顯像,觀察顯像劑在腫瘤灶的濃聚情況,用感興趣區(qū)(regionofinterest,ROI)技術(shù)計算腫瘤/對側(cè)正常組織(T/NT)的放射性計數(shù)比值。1.9均數(shù)統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SASV8.1統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組均數(shù)比較行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.19標(biāo)記條件的確定SnCl2·2H2O用量100μg、K237用量100μg、pH值6.0、反應(yīng)時間10～30min及室溫反應(yīng)溫度為99mTc-K237的最佳標(biāo)記條件,該條件下可得到標(biāo)記率>95%的99mTc-K237。2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和純度的注入最佳標(biāo)記條件下,99mTc-K237的標(biāo)記率和放化純均>95%。紙層析測得膠體和99mTcO—4為1.92%～2.44%。2.3主發(fā)射峰值時間K237標(biāo)準(zhǔn)品和99mTc-K237的保留時間分別為15.4和15.7min。99mTc-K237的HPLC洗脫曲線表明主放射峰值時間均約為15min;約24和27min處各有一小放射峰,共占總放射性計數(shù)的2.15%。2.49放置24h后,其放化純2組99mTc-K237在生理鹽水和正常人血清中放置24h后,其放化純分別為(89.14±1.42)%和(88.33±1.12)%,二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.56,P>0.05)。2.5非特異性細(xì)胞結(jié)合率99mTc-K237的總細(xì)胞結(jié)合率最高為(44.18±3.11)%,非特異性細(xì)胞結(jié)合率最高為(3.82±0.26)%,特異性細(xì)胞結(jié)合率最高為40.36%;99mTcO—4的細(xì)胞結(jié)合率最高為(2.87±0.43)%,表明標(biāo)記產(chǎn)物具有較好的生物學(xué)活性與特異性(表1)。2.69腎放射性下降99mTc-K237在小鼠血液中清除迅速,2h時放射性僅為30min時的18.66%;通過腎臟排泄較快,30min時腎放射性高達(dá)142.44%ID/g,2h時下降了53%;胃及甲狀腺的放射性始終處于低水平;心、肺、肝、脾、小腸及肌肉放射性隨時間逐漸下降;4h后除腎的放射性較高,其余各組織放射性呈低水平(表2)。2.7其他器官的觀察荷瘤鼠尾靜脈注射99mTc-K2371h后,即可見腫瘤部位有放射性濃聚,隨時間延長,3h腫瘤顯像最清晰。腎臟和膀胱有較高的放射性分布,其余器官如腦、肺、肝、小腸及肌肉等無明顯放射性濃聚,未見甲狀腺及胃顯像(圖1)。用ROI技術(shù)測得1、2、3、5及8h的T/NT比值分別1.25±0.11、3.13±0.26、3.97±0.31、1.34±0.29和1.18±0.25。3標(biāo)記物的篩選和生物活性的提高作為腫瘤顯像劑,放射性核素標(biāo)記的多肽或蛋白目前已得到了廣泛的研究和應(yīng)用。小分子多肽的放射性核素標(biāo)記分直接法和間接法。99mTc直接法標(biāo)記已成功用于含二硫鍵的小分子多肽,對于不含二硫鍵的小分子多肽,存在通過非巰基結(jié)合的標(biāo)記方法。Meléndez-Alafort等采用99mTc直接標(biāo)記抗菌勝肽ubiquicidin(UBI)29～41片段,其氨基酸序列中雖不含二硫鍵,但帶6個正電荷殘基(5Arg+1Lys),發(fā)現(xiàn)在高堿環(huán)境下,99mTc-UBI的平均放化純達(dá)97%,產(chǎn)物穩(wěn)定性好,且保留了同等的生物學(xué)活性,而Arg和Lys中的氨基是UBI最可能的結(jié)合位點(diǎn)。99mTc能直接通過結(jié)合組氨酸(His)的咪唑基團(tuán)而與蛋白質(zhì)或多肽形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。有作者在重組抗-癌胚抗原(anti-CEA)單鏈抗體片段的羧基末端接上6個His作為結(jié)合位點(diǎn),然后采用99mTc直接標(biāo)記,標(biāo)記率>95%,標(biāo)記過程并未造成抗體活性損失,產(chǎn)物具有較高的體內(nèi)外穩(wěn)定性?；谏鲜鲅芯?加之K237的氨基酸序列中雖不含Cys,但含有5個His,故99mTc可能通過結(jié)合His中的咪唑基團(tuán)而與K237形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。本研究采用99mTc直接標(biāo)記K237的方法,在最佳標(biāo)記條件下,得到標(biāo)記率和放化純均>95%的標(biāo)記物,并且具有較好的穩(wěn)定性和生物活性。標(biāo)記物經(jīng)HPLC分析,洗脫液放射峰值時間與紫外檢測保留時間基本一致(約15min),表明99mTc已成功標(biāo)記于K237上。保留時間約24和27min處的小峰為膠體和99mTcO—4,共占總放射性計數(shù)的2.15%。紙層析測得膠體和99mTcO—4為1.9%～2.4%,與HPLC洗脫液分析結(jié)果具有良好的一致性。分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,99mTc-K237在心臟和脾臟主要呈血池型分布,其濃度隨血液本底的清除而下降。標(biāo)記物在血液中迅速清除,有利于降低本底,增加靶/非靶組織放射性比值。胃和甲狀腺的放射性一直處于低水平,表明標(biāo)記物在體內(nèi)比較穩(wěn)定,無明顯脫锝現(xiàn)象。對荷瘤小鼠的顯像可見99mTc-K237在瘤體部位的高攝取提示99mTc-K237具有較好的體內(nèi)穩(wěn)定性,同時保留了較高的生物學(xué)活性。放射性核素標(biāo)記多肽在腫瘤血管生成的顯像和治療研究中被廣泛應(yīng)用。KDR是腫瘤新生血管形成過程中VEGF的主要受體,作為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性分子標(biāo)識,在人正常的內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)。Lei等從噬菌體12肽庫中篩選而獲得的12肽K237能與KDR高親和力結(jié)合,競爭性抑制VEGF結(jié)合KDR,顯著抑制由VEGF刺激而引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,DHFR-K237能顯著抑制雞胚尿囊膜血管形成和荷瘤裸鼠中腫瘤的生長。韋華等報道,在對前列腺癌細(xì)胞系LNc