中藥對腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型的干預作用及機制研究

中藥對腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型的干預作用及機制研究

控制和自然流產(chǎn)是目前國際生物科學領域的熱點之一。隨著生殖免疫學的發(fā)展,近年來研究認為,Th(T細胞輔助)1/Th2型細胞因子的平衡對于維持正常妊娠有積極的作用,一旦平衡打破則易導致病理妊娠。助孕3號方是在著名婦科專家羅元愷教授指導下擬定的防治自然流產(chǎn)的有效中藥復方,前期研究表明,其具有提高自然流產(chǎn)患者封閉抗體水平,提高免疫功能作用;可以在整體上保護各臟器功能,為妊娠提供良好的內(nèi)在整體環(huán)境;可有效維持妊娠黃體孕激素分泌,促進孕卵發(fā)育;增加子宮內(nèi)膜孕激素受體含量,抑制子宮收縮、降低其興奮性,從而使妊娠得以維持。為了進一步從細胞因子角度探討助孕3號方的作用機制,筆者采用前期腎虛黃體抑制病癥結合流產(chǎn)大鼠模型,觀察其細胞因子變化及補腎健脾中藥的干預作用,結果報道如下。1材料和方法1.1黃體酮注射液、il-10試劑羥基脲,上海中西制藥有限公司生產(chǎn),片劑,l00mg/片(批號:H19990263)。米非司酮,上海醫(yī)藥(集團)有限公司華聯(lián)制藥廠生產(chǎn),25mg/片(批號:H10950202)。黃體酮注射液,天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn),注射劑,l0mg/mL/支(批號:H12020534)。助孕3號方,由桑寄生、菟絲子、續(xù)斷、黨參、黃芪等八味中藥組成,藥液由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供。IL(白細胞介素)-2試劑均由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供(批號:070330)。IL-10試劑由北京北方生物技術研究所提供(批號:0704)。P(孕激素)試劑由北京東雅生物技術有限公司提供(批號:070325)。NO(一氧化氮)試劑由南京建成生物工程研究所第一分所提供。1.2儀器和測試方法JingLiLD4-2A離心機,江蘇國華儀器廠生產(chǎn)的SK-I快速混勻器,上海日環(huán)廠生產(chǎn)的SN-695B放免r測量儀,PE-1420多功能微孔板分析儀,上海精密儀器有限公司生產(chǎn)的722s可見分光光度計。1.3大鼠造模方法SPF級成熟SD大鼠,雌性64只,8～10周齡,體重約250～300g;雄性32只,10～12周齡,體重約350～380g。均購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心[許可證號為:SCXK(粵)2003～0001,粵監(jiān)證字2006A014]。所有雌鼠分為4組:助孕3號方組、黃體酮組、模型組、正常妊娠組。造模參照羅頌平教授腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠造模方法。以發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道涂片大量精子之日為妊娠第0天,除正常妊娠組,其余大鼠均于妊娠第1天至第10天予以羥基脲每天灌胃(450ng·kg-1,生理鹽水配置);妊娠第11天予以米非司酮灌胃(3.75mg·kg-1,生理鹽水配置)。助孕3號方組在造模同時,從妊娠第1天起給予助孕3號方灌胃(8mL·kg-1·d-1),連續(xù)10天;黃體酮組在造模同時,從妊娠第1天起給予黃體酮肌注(8mL,kg-1),隔天1次,連續(xù)10天;模型組在造模同時,從妊娠第1天起給予生理鹽水灌胃(8mL·kg-1·d-1),連續(xù)10天。正常妊娠組則從妊娠第1天起給予生理鹽水灌胃(8mL·kg-1·d-1),連續(xù)11天。妊娠第11天灌服米非司酮24小時后,乙醚麻醉各組大鼠,目眥取血,收集靜脈血,處死各組大鼠,將妊娠子宮離體。1.4一般觀察觀察大鼠形態(tài)、毛色、活動、納食、大便等變化。1.5血清指數(shù)的檢測放免法測定大鼠血清IL-2、IL-10及P含量。比色法測定大鼠血清NO水平。1.6胚胎吸收結果觀察各組孕鼠離體子宮重量、正常胚胎及吸收胚胎情況,計算胚胎吸收率。正常胚胎:宮內(nèi)未見瘀血,胚胎呈粉紅色。吸收胚胎:宮內(nèi)見瘀血,胚胎呈黑褐色。胚胎吸收率(R)=被吸收胚胎數(shù)(Re)/[Re+存活胚胎數(shù)(F)]。1.7統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)用(±s)表示,運用SPSSforWindows軟件處理數(shù)據(jù)。2結果2.1兩組體重減輕程度比較除正常妊娠組外,其余各組大鼠均有不同程度的毛松、毛干枯、倦臥、活動力下降、納食減少、大便稀爛、體重減輕等腎虛癥狀。助孕3號方組體重減輕程度較模型組輕微,差異有顯著性意義(P<0.05);而黃體酮組體重減輕程度與模型組比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。2.2各組大鼠血清細胞因子的比較見表1。與模型組比較,正常妊娠組、助孕3號方組大鼠血清IL-2水平、IL-2/IL-10比值明顯降低(P<0.05)。2.3血清no含量見表2。與模型組比較,助孕3號方組、黃體酮組及正常妊娠組血清P含量均明顯升高(P<0.05),血清NO含量均明顯降低(P<0.05)。見表3。與模型組比較,助孕3號方組、黃體酮組、正常妊娠組大鼠胚胎吸收率均明顯下降(P<0.05),而助孕3號方組、黃體酮組、正常妊娠組間胚胎吸收率比較,差異均無顯著性意義(P>0.05)。3討論3.1腎藏精,注重生理本研究所采取的腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型參照了羅頌平教授前期關于造模方法的研究,即采用羥基脲和米非司酮建立腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型,模擬了臨床上腎虛型自然流產(chǎn)的狀態(tài),模型動物出現(xiàn)毛發(fā)干枯、活動遲緩、倦臥、血清P水平下降、蛻膜孕激受體表達抑制、流產(chǎn)等腎虛和黃體抑制的表現(xiàn)。腎藏精,為元陰、元陽所居,主生長發(fā)育和生殖。妊娠后,腎氣充盛、氣血充足,沖任功能正常,則胚胎發(fā)育生長正常。若腎氣不足、氣血虧虛,臟腑功能失調(diào),使胎失載養(yǎng),胎失所固,則胎難成熟而殞墮。一些學者結合現(xiàn)代醫(yī)學的微觀病因與中醫(yī)學的宏觀辨證研究認為,由于免疫因素或內(nèi)分泌因素引起的自然流產(chǎn),中醫(yī)辨證多與腎相關,并將母胎免疫識別低下型自然流產(chǎn)中醫(yī)辨證歸屬腎虛范圍。因此,本研究選取腎虛黃體抑制型流產(chǎn)大鼠模型來探討Thl/Th2型細胞因子與自然流產(chǎn)的相關性以及助孕3號方的干預作用。3.2羥基哌加米非司酮致妊娠大鼠細胞因子間比例失調(diào)生殖免疫學認為,妊娠是一個同種異體移植的過程,Th1/Th2型細胞因子的平衡對維持妊娠起著重要的作用。Th1型細胞因子主要介導細胞免疫和局部炎癥反應,具有細胞毒作用,阻礙胚胎的生長發(fā)育;Th2型細胞因子主要介導體液免疫和同種免疫排斥耐受,對妊娠的維持起著積極的作用。Th1型細胞因子過度表達,Th2型細胞因子表達不足,Th1、Th2型細胞因子間比例失調(diào),是引起自然流產(chǎn)的重要因素。P和NO均能調(diào)節(jié)Th1/Th2間平衡。其中,P有利于Th1/Th2間平衡向Th2方向偏移,利于Th2型反應,有利于妊娠的維持。NO則具有雙向調(diào)節(jié)的作用,正常妊娠時,NO能夠抑制Th1型反應。然而,NO表達過度則反而會抑制Th2型反應,促進Th1型反應,不利于妊娠。本研究中,模型組大鼠血清IL-2含量較正常妊娠組明顯上升,IL-2/IL-10比值明顯升高,血清P水平較正常組明顯下降,而血清NO含量則較正常妊娠組明顯升高。因此,筆者認為,羥基脲加米非司酮致腎虛黃體抑制流產(chǎn)大鼠模型可引起實驗大鼠Th1型細胞因子水平的明顯上升,其細胞毒作用可能是引起妊娠大鼠胚胎吸收率增加的重要原因。同時,NO表達過度,抑制了Th2型細胞因子的作用,一定程度上促進了Th1型細胞因子的表達,而且模型組大鼠P明顯不足,無法抑制過高的Th1型反應,使得Th1/Th2平衡無法維持在相對穩(wěn)定狀態(tài),而表現(xiàn)為Th1反應占主導地位的偏移,影響了胚胎的正常生長發(fā)育。3.3妊娠大鼠血清il-2含量NO的影響助孕3號方是防治自然流產(chǎn)的有效方劑,前期動物實驗表明,助孕3號方可以從整體上保護各臟器功能,有效提高妊娠大鼠子宮內(nèi)膜孕激素受體含量,提高妊娠大鼠血清P水平,維持妊娠黃體孕激素分泌,抑制子宮收縮,有效降低胚胎吸收率。本研究顯示,助孕3號方能明顯降低妊娠大鼠血清IL-2含量及IL-2/IL-10比值,并且優(yōu)于黃體酮;能夠有效提高妊娠大鼠血清P水平并降低血清NO含量,其療效與黃體酮比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。助孕3號方通過抑制IL-2的表達,糾正以Th1型反應為主的失衡狀態(tài),并可有效增加大鼠血清P分泌,有助于對Th1型反應的抑制,促進平衡逆轉。同時,助孕3號方降低了大鼠血清NO的含量,也在一定程度上減少了對Thl型反應的