川芎嗪對(duì)骨髓移植后小鼠骨髓中干細(xì)胞因子表達(dá)的影響

川芎嗪對(duì)骨髓移植后小鼠骨髓中干細(xì)胞因子表達(dá)的影響

川藥亭通過(guò)改善骨骼循環(huán)，促進(jìn)骨髓微血管系統(tǒng)的修復(fù)，改善骨髓微環(huán)境，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和粘附能力，促進(jìn)血漿干細(xì)胞的繁殖。干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF),即盒配體(kitligand),它通過(guò)與c-kit受體結(jié)合引發(fā)其促進(jìn)造血干細(xì)胞的生存、增殖和分化的作用。本試驗(yàn)通過(guò)觀察川芎嗪對(duì)骨髓移植(BMT)后小鼠骨髓中SCF的表達(dá)水平及小鼠的外周血計(jì)數(shù)和骨髓的組織學(xué)變化,進(jìn)一步探討川芎嗪促進(jìn)BMT小鼠造血重建的作用機(jī)制。1小鼠骨髓中bmt活性的檢測(cè)1.1試驗(yàn)動(dòng)物清潔型近交系BALB/C小鼠,雄性,8~10周齡,17~20g,由湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。1.2藥物及試劑鹽酸川芎嗪注射液,每毫升含鹽酸川芎嗪20mg(北京市永康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)),硫酸慶大霉素注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)),乳糖酸紅霉素(哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)),SAP法監(jiān)測(cè)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司提供),兔抗小鼠SCF多抗(購(gòu)于SantaCruzBiotechnology,Inc.),BCIP/NBT顯色劑(購(gòu)于華美生物工程公司),HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)。1.3分組及處理清潔級(jí)BALB/C小鼠72只,將小鼠隨機(jī)分為3組。正常組8只,未做任何處理;BMT對(duì)照組(下簡(jiǎn)稱BMT組)及BMT+川芎嗪處理組(下簡(jiǎn)稱川芎嗪組)各32只,經(jīng)以下步驟處理:①預(yù)處理:在照射l周前和照射后3周喂飲小鼠慶大霉素(32×104U/L)和紅霉素(250mg/1);②照射:移植前4h經(jīng)60Coγ射線全身均勻照射,總劑量8.0Gy,劑量率為0.5Gy/min;③BMT模型的建立:取正常的BALB/C小鼠,頸椎脫臼處死后,75%的乙醇浸泡10min,在超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌剪立即取雙側(cè)股骨,用RPMI1640沖出骨髓腔內(nèi)的骨髓,制備有核細(xì)胞懸液,調(diào)濃度至2×107/ml,4h內(nèi)經(jīng)尾靜脈,注入受照射的對(duì)照組及川芎嗪組小鼠體內(nèi)(供體鼠和受體鼠比例為1:4),注入細(xì)胞數(shù)為2×106/只,液體量0.2ml/只:④藥物干預(yù):制BMT模型后,川芎嗪組小鼠立即胃飼鹽酸川芎嗪注射液2mg/只,2次/d;對(duì)照組胃飼生理鹽水,0.2ml/只,2次/d。以上兩組均用藥至處死為止。1.4外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)將BMT后第+7、+14、+21天各組小鼠取眼眶血處死,收集眶血以二已酸四乙二鉀抗凝。計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞和血小板數(shù)。1.5骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNC)計(jì)數(shù)于BMT后第+7、+14、+21天BMT組和川芎嗪組各取8只小鼠,頸椎脫臼法處死,浸入75%乙醇3min,取雙側(cè)股骨,用RPMI1640從骨髓腔沖出單個(gè)核細(xì)胞,按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法,計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞。1.6骨髓組織學(xué)觀察將BMT后第+7、+14、+21天小鼠分別處死后,立即取一側(cè)肱骨,以體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛固定,低溫塑料包埋,室溫下尺骨中段橫面切片和矢狀切面,HE染色,于10×40高倍鏡下使用5×5網(wǎng)格計(jì)數(shù)器觀察以下指標(biāo):①估算造血組織的增生度、脂肪組織增生情況和微血管、血竇擴(kuò)張破裂出血的程度,隨機(jī)記取15個(gè)視野中造血組織、脂肪組織、及血竇中紅細(xì)胞各自的點(diǎn)計(jì)數(shù),并計(jì)算各自所占的比例即為以上三者各自所占的容量:②計(jì)數(shù)每個(gè)切面上15個(gè)高倍鏡視野(HGF)下的巨核細(xì)胞數(shù),求得每HGF下平均巨核細(xì)胞數(shù),以觀察巨核細(xì)胞系的恢復(fù)情況。1.7BMT后骨髓組織切片中SCF表達(dá)水平BMT后第+7、+14、+21天處死小鼠后,立即取一側(cè)肱骨,常規(guī)固定脫鈣,浸蠟包埋,矢狀面切片(3μm),常規(guī)脫蠟至水、微波抗原修復(fù)、山羊血清室溫下封閉30min、依次加入一抗(兔抗小鼠SCF多抗)4℃孵育過(guò)夜、生物素標(biāo)記的二抗(山羊抗小鼠、兔、豚鼠和大鼠IgG)37℃孵育30min、堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素(S-A/AP)37℃孵育30min、BCIP/NBT顯色劑顯色15~20min,干燥后中性樹(shù)膠封片,HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量SCF陽(yáng)性面積百分?jǐn)?shù)。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1+21天的白領(lǐng)和血小板計(jì)數(shù)表1顯示,川芎嗪組在BMT后第+7、+14、+21天的白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)均高于BMT組(P<0.05或<0.01),兩組在第+21天時(shí)白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)仍未恢復(fù)正常。2.2川芎嗪組與bmt組bmnc的比較表1顯示,BMT后第+7天川芎嗪組和BMT組的BMNC急劇減低明顯低于正常(P<0.01),川芎嗪組高于BMT組(P<0.05),川芎嗪組在BMT后第+14、+21天的BMNC數(shù)也顯著高于BMT組(P<0.01),而兩組BMNC數(shù)至第+21天時(shí)與正常組仍有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。2.3兩組bmt、bmt及正常組的血竇功能比較見(jiàn)表1表2顯示,觀察BMT后第+7、+14、+21天BMT組和川芎嗪組同一切片上造血組織、脂肪組織及微血管血竇的相對(duì)比例。我們發(fā)現(xiàn)川芎嗪組在BMT后各時(shí)期的造血組織容量百分率均顯著高于BMT組(P<0.05或P<0.01),而均低于正常組(P<0.01)。在BMT后第+7、+14天川芎嗪組脂肪組織容量顯著高于BMT組(P<0.01),而至第+21天時(shí)川芎嗪組轉(zhuǎn)而低于BMT組(P<0.01),同時(shí)兩組在BMT后第+7至+21天的脂肪組織的容量均顯著高于正常組(P<0.01)。川芎嗪組血竇中成熟紅細(xì)胞容量在第+7天至+21天均顯著高于BMT組(P<0.01),兩組的成熟紅細(xì)胞容量在+7、+14天均顯著高于正常組(P<0.01),而B(niǎo)MT組在+21天時(shí)仍高于正常組。第+7天BMT組和川芎嗪組均為見(jiàn)到巨核細(xì)胞,第+14、+21天川芎嗪組的巨核細(xì)胞顯著高于BMT組(P<0.05),但仍低于正常組(P<0.01)。2.4兩組scf的比較表1顯示,BMT后第+7至+14天,川芎嗪組和BMT組的SCF的表達(dá)水平均明顯低于正常(P<0.01),川芎嗪組顯著高于BMT組(P<0.05);到BMT第+21天川芎嗪組已恢復(fù)正常水平,而明顯高于BMT組。3川浚嗪對(duì)bmt小鼠骨髓中scf表達(dá)的影響干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF),又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(mastcellgrowthfactor,MGF),是原癌基因c-kit的配體。SCF主要由內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞產(chǎn)生,以局限于細(xì)胞膜表面的膜結(jié)合型和通過(guò)酶蛋白消化后產(chǎn)生的分泌型兩種形式存在。膜結(jié)合型的SCF是干細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)必需的,而可溶型的SCF是干細(xì)胞短期擴(kuò)增所必需的。因此膜結(jié)合型SCF對(duì)于維持骨髓造血功能更加重要。SCF對(duì)外周血骨髓中的CD34+群中的高增殖潛能祖細(xì)胞(HPC)有趨化和活化的作用,并可能參與了HPC到骨髓的遷移并防止骨髓外的HPC的自發(fā)性動(dòng)員。同時(shí),SCF能夠直接富集富有造血干細(xì)胞的細(xì)胞群并加速其進(jìn)入細(xì)胞周期,調(diào)節(jié)干細(xì)胞的粘附特性。有研究表明SCF和IL-3及其它細(xì)胞因子合用時(shí),可明顯增加BFU-E(紅系爆式集落形成單位)、CFU-GM(粒單系集落形成單位)、CFU-GEMM(混合集落形成單位)的數(shù)量。此外,體內(nèi)干細(xì)胞的自我更新也依賴于SCF。大量研究顯示,SCF可增加前B細(xì)胞對(duì)IL-7的增殖的反應(yīng)性,進(jìn)而促進(jìn)B淋巴細(xì)胞生成,并且在T淋巴細(xì)胞發(fā)生的早期階段發(fā)揮重要作用。因此,SCF在促進(jìn)造血細(xì)胞的生存、增殖和分化中起著重要的作用。川芎嗪是傳統(tǒng)活血化瘀中藥川芎的有效成分,它有抗血小板聚集,擴(kuò)張小動(dòng)脈,改善微循環(huán)的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示川芎嗪能促進(jìn)放射損傷及免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠微血管的修復(fù),增加微血管數(shù)量,增加骨髓微環(huán)境供養(yǎng),促進(jìn)造血細(xì)胞增生,促進(jìn)BMT后骨髓重建造血。川芎嗪促進(jìn)骨髓造血的作用是肯定的,然而其作用機(jī)制目前不清。為了進(jìn)一步闡明其可能的機(jī)制,我們動(dòng)態(tài)檢測(cè)了BMT后骨髓中SCF的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,川芎嗪能明顯提高BMT后骨髓中SCF的表達(dá)水平,促進(jìn)造血細(xì)胞增生。川芎嗪組BMT后第+7、+14、+21天小鼠的巨核細(xì)胞提早出現(xiàn),外周血白細(xì)胞、血小板的數(shù)量及骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量顯著增加,骨髓微血管、血竇的擴(kuò)張淤血明顯減輕,造血組織面積及脂肪組織