皮質(zhì)形成細(xì)胞凋亡與銀屑病病情的相關(guān)性研究

皮質(zhì)形成細(xì)胞凋亡與銀屑病病情的相關(guān)性研究

癲癇發(fā)作不僅與角質(zhì)細(xì)胞（kc）的異常增生有關(guān)，還與kc的疾病有關(guān)。研究表明,凋亡發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的、由半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程,其中caspase-3是caspases家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一。我們采用比色法檢測(cè)30例銀屑病患者皮損中活性caspase-3的含量;TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測(cè)銀屑病患者皮損中KC凋亡狀況并計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI);對(duì)其中26例尋常型銀屑病患者進(jìn)行臨床病情評(píng)分,探討細(xì)胞凋亡與銀屑病病情的相關(guān)性。1活性caspase-3檢測(cè)2002年9月至2002年12月期間在湘雅醫(yī)院、湘雅二醫(yī)院和湘雅三醫(yī)院皮膚性病科門診或住院的銀屑病患者共30例,經(jīng)臨床和病理證實(shí),其中尋常型26例(包括斑塊狀22例,點(diǎn)滴狀4例;進(jìn)行期12例,靜止期9例,消退期5例),泛發(fā)性膿皰型4例。男23例,女7例。年齡8~77(37.8±19.15)歲。病程1周~30年。實(shí)驗(yàn)前至少1個(gè)月內(nèi)未使用皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑、維A酸類藥物,亦未接受其他系統(tǒng)治療,不伴有腫瘤及其他嚴(yán)重疾患。皮損處行手術(shù)取材法,尋常型者取鱗屑性紅斑或斑塊,膿皰型者取紅斑基礎(chǔ)上的膿皰。切取約0.7cm×1.5cm大小的皮膚全層組織。標(biāo)本切取后剪成兩份,一份常規(guī)10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,室溫存放,以備組織病理檢查及細(xì)胞凋亡檢測(cè);另一份盡量剪去皮下組織后放入生理鹽水中洗去表面血跡,紗布吸干,立即放入1.5mL離心管中,經(jīng)液氮速凍后,置于-70℃冰箱中保存,以備檢測(cè)活性caspase-3。對(duì)照組皮膚20例,取自同期普外及骨科手術(shù)切緣,系非皮膚病及腫瘤手術(shù)者的正常皮膚。標(biāo)本處理與試驗(yàn)組相同。采用銀屑病皮損面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)對(duì)26例銀屑病患者就診時(shí)予以病情程度評(píng)分。所取皮疹根據(jù)各個(gè)部位紅斑(E)、浸潤(rùn)(I)和脫屑(D)的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分?；钚詂aspase-3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司。標(biāo)本研磨后,充分裂解,取45μL上清液至空白酶標(biāo)板,PBS液作空白對(duì)照,每孔加入50μL反應(yīng)緩沖液及5μLDEVD-pNA(活性caspase-3底物)37℃水浴1h后,在酶標(biāo)儀上讀取A405值。通過(guò)蛋白定量(考馬斯亮蘭法),計(jì)算單位質(zhì)量蛋白中的A405值,代表該樣本的活性caspase-3相對(duì)含量。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。石蠟包埋組織5μm連續(xù)切片,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。細(xì)胞核染為黃色者為凋亡細(xì)胞。每張切片選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞最多的高倍視野(×400),計(jì)算1000個(gè)KC中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比,為凋亡指數(shù)(AI)。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用xˉ±sxˉ±s表示,兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。多樣本均數(shù)的比較采用方差分析,相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。分析變量間的依存關(guān)系采用直線回歸方程。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1抗pas檢測(cè)結(jié)果正常表皮中僅見(jiàn)個(gè)別凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組中均可見(jiàn)細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞(圖1~3),AI為5.0%~45.0%,活性caspase-3檢測(cè)結(jié)果為0.37~4.14,銀屑病組AI值、活性caspase-3檢測(cè)結(jié)果明顯高于正常組。斑塊型、點(diǎn)滴型、膿皰型銀屑病的AI比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.619,P<0.05)。其中膿皰型銀屑病皮損組織AI顯著高于斑塊型和點(diǎn)滴型(P<0.05),斑塊型與點(diǎn)滴型之間AI的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三型銀屑病皮損組織中活性caspase-3的含量以膿皰型為最多,點(diǎn)滴型最少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。2.2遮光定量檢測(cè)各組皮質(zhì)組織中caspase-3的表達(dá)表達(dá)的差別26例尋常型銀屑病患者中,進(jìn)行期、靜止期、消退期的AI差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.921,P<0.01)。其中進(jìn)行期銀屑病皮損組織AI高于靜止期和消退期(P<0.05),而靜止期與消退期之間AI的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三期銀屑病皮損組織中活性caspase-3的表達(dá)量比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.416,P<0.01)。其中進(jìn)行期銀屑病皮損組織活性caspase-3的表達(dá)量顯著高于靜止期和消退期(P<0.05),而靜止期與消退期之間活性caspase-3表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。2.3生長(zhǎng)因子26例尋常型銀屑病PASI評(píng)分為2.6~39.2(11.07±9.58)分。通過(guò)直線相關(guān)分析顯示,銀屑病患者PASI臨床評(píng)分與AI及皮損處活性caspase-3含量之間均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(分別r=0.358,P>0.05;r=0.362,P>0.05)。2.4326例尋常型銀屑病所取皮損的局部病變嚴(yán)重程度評(píng)分為2~10(5.4±2.3)分。經(jīng)直線相關(guān)分析證實(shí),局部病變嚴(yán)重程度評(píng)分與AI及活性caspase-3含量呈中度正相關(guān)(分別r=0.419,P<0.05;r=0.511,P<0.01)(圖4~5)。3皮質(zhì)kc凋亡細(xì)胞凋亡是生命的基本特征之一,它與細(xì)胞增殖共同維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在正常表皮,KC增殖速率與凋亡速率相等,以維持表皮細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。銀屑病病理生理的一個(gè)重要特點(diǎn)是表皮基底層的KC增殖加速。Goldsmith等研究發(fā)現(xiàn),蟾蜍表皮脫落的周期很短,在表皮細(xì)胞迅速增生的同時(shí),有大量分化細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡狀態(tài),形成角質(zhì)層而脫落,從而使蟾蜍表皮更新處于平衡狀態(tài)。由此推論,銀屑病表皮角化不全和大量的鱗屑脫落現(xiàn)象類似于蟾蜍脫皮表現(xiàn)。研究銀屑病皮損部位細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)促凋亡基因Fas,p53,C-myc等表達(dá)增強(qiáng),而抑制凋亡的基因bcl-2表達(dá)減低,說(shuō)明在銀屑病皮損KC凋亡增加。本研究采用TUNEL法及檢測(cè)凋亡中的活性caspase-3,直接和間接證實(shí)銀屑病皮損處KC凋亡明顯增多。推測(cè)這是細(xì)胞增生的同時(shí)伴隨的一種自我限制和平衡機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),尋常型銀屑病患者PASI評(píng)分與KC的凋亡無(wú)明顯相關(guān),皮損局部病變嚴(yán)重程度評(píng)分與KC的凋亡呈正相關(guān)。由于PASI主要是評(píng)價(jià)患者全身的病情程度,而皮損局部病變嚴(yán)重程度評(píng)分主要評(píng)價(jià)所取皮疹的嚴(yán)重程度,提示KC凋亡可能與銀屑病表皮局部的病理變化有關(guān),而與全身皮疹的泛發(fā)程度無(wú)關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)膿皰型銀屑病KC凋亡高于尋常型銀屑病;尋常型銀屑病中進(jìn)行期KC凋亡高于靜止期和消退期;靜