衛(wèi)生化學(xué)：分子熒光分析法

1molecularfluorescenceanalysis

第五章分子熒光分析法2熒光：物質(zhì)分子吸收光后，從激發(fā)態(tài)的最低振動能級去激發(fā)回到基態(tài)所發(fā)出的光。分類(1)根據(jù)物質(zhì)吸收激發(fā)光的波長不同：Ｘ射線熒光、

紫外-可見熒光和紅外熒光。(2)根據(jù)發(fā)射熒光的粒子不同：分子熒光和原子熒光熒光分析法：利用熒光物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)定性和定量分析的方法。3

特點：（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；檢測下限：10-7~10-9

g/mL（2）選擇性強熒光物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，其吸收激發(fā)光的波長和發(fā)射熒光的波長均不同。（3）試樣量少缺點：應(yīng)用范圍小。41.分子能級與能級多重性物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動：電子能級，振動能級，轉(zhuǎn)動能級。每個電子能級含有若干振動能級。大多數(shù)有機分子含有偶數(shù)個電子。室溫時，分子中的電子成對的填充在能量最低的各軌道中。根據(jù)Pauli不相容原理，在給定軌道中的兩個電子必須具有相反的自旋方向，自旋量子數(shù)S分別為1/2和-1/2，總自旋量子數(shù)S=0。電子能級的多重度M=2S+1，當(dāng)S=0時，M=1，電子能級狀態(tài)稱為單重態(tài)或單線態(tài)。一、分子熒光的產(chǎn)生過程第一節(jié)

基本原理5處于分立的電子軌道的非成對電子，平行自旋比配對自旋更穩(wěn)定，因此，三重激發(fā)態(tài)的能級比相應(yīng)的單重激發(fā)態(tài)的能級低。

大多數(shù)有機分子的基態(tài)為單重態(tài)分子吸收能量后發(fā)生能級躍遷，當(dāng)基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。激發(fā)單重態(tài)。如果電子躍遷過程中發(fā)生自旋方向改變，即分子具有兩個自旋平行不配對電子，其總自旋量子數(shù)S=1，分子中電子能級的多重度M=2S+1=3，此時分子所處的能級狀態(tài)稱為三重態(tài)或三線態(tài)。62.熒光的產(chǎn)生常溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能級。處于基態(tài)的分子吸收能量（電能、熱能、化學(xué)能、光能）后被激發(fā)至激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射躍遷或無輻射躍遷釋放能量返回基態(tài)，這個過程稱為去激發(fā)過程。發(fā)射熒光是其去激發(fā)的其中一種途徑。7

3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)部轉(zhuǎn)移外部轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷81.振動馳豫這一過程只能發(fā)生在同一電子能級內(nèi)，即分子通過碰撞以熱的形式損失部分能量，從較高振動能級下降到該電子能級的最低振動能級上。由于這一部分能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射形式發(fā)出，故振動馳豫屬于無輻射躍遷。2.內(nèi)部轉(zhuǎn)移當(dāng)兩個電子能級非常接近時，激發(fā)態(tài)分子從較高電子能級降至較低的電子能級，將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?。?nèi)部轉(zhuǎn)換也屬于無輻射躍遷。3.熒光較高激發(fā)態(tài)分子經(jīng)無輻射躍遷降至第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級后，仍不穩(wěn)定，停留較短時間后（約10-8s，稱作熒光壽命），以光輻射形式放出能量，回到基態(tài)各振動能級，這時所發(fā)射的光稱為熒光。94.系間跨躍有些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過振動馳豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級后，有可能經(jīng)過另一個無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至激發(fā)三重態(tài)，這一過程伴隨著自旋方向的改變，稱為系間跨躍。對于大多數(shù)物質(zhì)，系間跨躍是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，電子自旋方向可以改變，系間跨躍就變得容易了。需要注意的是：（1）整個過程是在單線態(tài)之間進行的；（2）產(chǎn)生熒光的過程極快，約在10-8秒左右內(nèi)完成；（3）熒光的產(chǎn)生是由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級開始，而與熒光分子被激發(fā)至哪一個能級無關(guān)。因此，熒光光譜的形狀和激發(fā)光的波長無關(guān)。106.外部轉(zhuǎn)移由于激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互碰撞，到達第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級的電子以無輻射躍遷方式回到基態(tài)各振動能級，這個過程成為外部轉(zhuǎn)移。外部轉(zhuǎn)移能使熒光的強度減弱甚至消失，這種現(xiàn)象稱為熒光猝滅或熄滅。5.磷光經(jīng)系間跨躍的分子再通過振動馳豫降至第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級，停留一段時間（10-4～10s，稱作磷光壽命），然后以光輻射形式放出能量返回到基態(tài)各振動能級，這時發(fā)出的光稱為磷光（phosphorescence）。由于激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)最低振動能級能量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，即磷光的波長比熒光更長。11S2S1S0T1吸光

熒光

磷光系間跨越內(nèi)部轉(zhuǎn)移能量

外部轉(zhuǎn)移T2振動弛豫吸光振動弛豫內(nèi)部轉(zhuǎn)移12

二、激發(fā)光譜和熒光光譜

excitationspectrumandfluore-scencespectrum熒光的檢測

光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進入檢測器，檢測不同發(fā)射波長下的熒光強度F。13

任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜(excitationspectrum)和熒光光譜(fluorescencespectrum)。

1.激發(fā)光譜不同激發(fā)波長引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。保持熒光發(fā)射波長不變（固定發(fā)射單色器），依次改變激發(fā)光波長（調(diào)節(jié)激發(fā)單色器），測定不同波長的激發(fā)光激發(fā)下得到的熒光強度F。然后以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，以熒光強度F為縱坐標(biāo)作圖，就可得到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。14激發(fā)光譜上熒光強度最大值所對應(yīng)的波長就是最大激發(fā)波長（λex），是激發(fā)熒光最靈敏的波長。物質(zhì)的激發(fā)光譜與它的吸收光譜相似，所不同的是縱坐標(biāo)。2.熒光光譜熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā)光波長不變（即固定激發(fā)單色器），依次改變熒光發(fā)射波長（調(diào)節(jié)發(fā)射單色器），測定樣品在不同波長處發(fā)射的熒光強度F。以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，以熒光強度F為縱坐標(biāo)作圖，得到熒光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜上熒光強度最大值所對應(yīng)的波長就是最大發(fā)射波長（λem）。15激發(fā)光譜熒光光譜16173.熒光光譜的特征

（1）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

由于熒光是分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回到基態(tài)的各振動能級時釋放的光輻射，與分子被激發(fā)至哪一個電子激發(fā)態(tài)無關(guān)。18

(2）熒光光譜比激發(fā)光譜波長長

由于分子吸收激發(fā)光被激發(fā)至較高激發(fā)態(tài)后，先經(jīng)無輻射躍遷（振動馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換）損失掉一部分能量，到達第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再由此發(fā)出熒光。因此，熒光發(fā)射能量比激發(fā)光能量低，熒光光譜波長比激發(fā)光波長長。

（3）熒光光譜與激發(fā)光譜的形狀呈鏡像對稱對于高度對稱的有機分子，其熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像對稱關(guān)系。19解釋：能級結(jié)構(gòu)相似性熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級躍遷到基態(tài)的各個振動能級而形成，即其形狀與基態(tài)振動能級分布有關(guān)。激發(fā)光譜是由基態(tài)最低振動能級躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個振動能級而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動能級分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動能級分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。20

三、熒光與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

（一）物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件一種物質(zhì)能否發(fā)熒光以及熒光強度的高低，與它的分子結(jié)構(gòu)及所處的環(huán)境密切相關(guān)。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)都應(yīng)同時具備兩個條件：1.物質(zhì)分子必須有強的紫外-可見吸收；2.物質(zhì)具有較高的熒光效率熒光效率：激發(fā)分子的去激發(fā)過程包括輻射躍遷和無輻射躍遷兩種。輻射躍遷可發(fā)射熒光，有多少比例的激發(fā)分子發(fā)射出熒光可以用熒光效率表示

F21激發(fā)發(fā)射

2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

（1）躍遷類型：大多數(shù)能發(fā)熒光的化合物都是由→*或n→*躍遷激發(fā)。22(2)共軛效應(yīng)化合物λex

λem苯0.11

205

278萘0.29286321蒽0.36356404一般而言，π電子共軛體系越大，熒光效率越高，且熒光波長長移。23

（3）剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)可減少分子的振動，使分子與溶劑和其它溶質(zhì)分子的相互作用減小，減少能量外部轉(zhuǎn)移的損失，因而有利于提高熒光效率。24(4)取代基效應(yīng)

給電子基團：如–OH,–OR,–NH2,–CN，–NR2等，能增加分子的π電子共軛程度，增強熒光。

吸電子基團：如–COOH,,–NO2,–NO等，可減弱分子π電子共軛性，減弱甚至熄滅熒光。熒光分子上的各種取代基對分子的熒光光譜和熒光強度都有很大影響。

還有一類取代基則對熒光的影響不明顯，如—R、—SO3H等。25化合物熒光相對強度苯10苯酚18苯胺20苯甲酸3硝基苯026四、影響熒光強度的外部因素溫度溫度對被測溶液的熒光強度有明顯的影響。當(dāng)溫度升高時，介質(zhì)粘度減小，分子運動加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無輻射躍遷增加，熒光效率降低。故降低溫度有利于提高熒光效率及熒光強度。溶劑同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光光譜的位置和熒光強度可能會有一定的差別，尤其是那些分子中含有極性取代基的熒光物質(zhì)，它們的熒光光譜易受溶劑的影響。27溶劑的影響可以分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。一般溶劑效應(yīng)是指溶劑極性的影響。通常情況下，隨著溶劑極性增大，

～

*躍遷所需的能量差

E減小，躍遷幾率增加，從而使熒光波長長移，熒光強度增大。特殊溶劑效應(yīng)是指溶劑與熒光物質(zhì)形成化合物，或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，使熒光峰的波長和熒光強度都發(fā)生較大變化。溶劑極性越大，分子與溶劑的靜電作用越強，使激發(fā)態(tài)穩(wěn)定,能量降低。即π*軌道能量降低大于π軌道能量降低，因此波長長移。28pH值溶液的酸度（pH值）對熒光物質(zhì)的影響可以分兩個方面：1．影響熒光物質(zhì)的存在形式：若熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，溶液pH值改變，物質(zhì)分子和其離子間的平衡也隨之發(fā)生變化，熒光強度也不同。每一物質(zhì)都有它最合適發(fā)射熒光的存在型體，也就是它最合適的pH范圍。2.影響熒光配合物的組成：對于金屬離子與有機試劑生成的熒光配合物，溶液pH值的改變會影響配合物的組成，從而影響它們的熒光性質(zhì)。例如Ga3+離子與鄰-二羥基偶氮苯，在pH3～4的溶液中形成1:1配合物，能產(chǎn)生熒光。而在pH6～7的溶液中，則形成1

2的配合物，不產(chǎn)生熒光。29散射光當(dāng)一束光照射在被測溶液上，其中一部分光被吸收后發(fā)出熒光，一部分光透過溶液，還有一小部分光則由于光子與溶劑分子的相互碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同方向散射，稱為散射光。1.瑞利（Reyleigh）散射光光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量的交換，只是光子運動方向發(fā)生改變，其波長和激發(fā)光相同，這種散射光稱為瑞利散射光。它的強度與波長的四次方成反比，即波長越短，瑞利散射光越強。但因瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，只要選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y定波長或選用濾光片即可消除其影響。

302.拉曼（Raman）散射光光子和溶劑分子發(fā)生非彈性碰撞，在運動方向發(fā)生改變的同時，光子與溶劑分子還發(fā)生能量的交換，使光子能量減小或者增加，光的波長增長或變短，這兩種散射光均稱為拉曼（散射）光。波長較長的拉曼光因其波長與物質(zhì)的熒光波長相接近,故對測定的干擾較大。由于拉曼光波長隨激發(fā)光波長的改變而改變,而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān),故通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長，就可以將二者區(qū)分開。

31320nm320nm448nm350nm448nm350nm400nm360nm激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm硫酸奎寧散射光譜散射光譜32熒光熄滅由于熒光物質(zhì)分子與溶劑或與其它物質(zhì)分子相互作用，引起熒光強度顯著下降或熒光強度與濃度不呈線性的現(xiàn)象叫做熒光熄滅。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。造成熒光熄滅的原因有多種：（1）激發(fā)態(tài)熒光分子和熄滅劑分子碰撞，將能量轉(zhuǎn)移到熄滅劑而使熒光熄滅；（2）熒光分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配合物；（3）熒光物質(zhì)分子中引入溴或碘后，易發(fā)生系間跨越而轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)；（4）當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生熒光自熄滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，自熄滅現(xiàn)象越嚴(yán)重；（5）溶液中溶解的氧分子能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅。33熒光熄滅是熒光分析的不利因素。但是如果一個熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強度的減小和熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可以利用這一性質(zhì)建立熄滅劑的熒光分析法，稱為熒光熄滅法。熒光熄滅法比直接熒光法更靈敏、更有選擇性。例如鋁-桑色素配合物的熒光強度因微量氟離子的存在而引起熒光熄滅，利用這種性質(zhì)可測定樣品中微量氟離子的含量，這時溶液的熒光強度和氟離子濃度成反比。34第二節(jié)定性和定量分析一、定性分析熒光物質(zhì)的特征光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜，因此用它鑒定物質(zhì)比吸收光譜可靠。紫外-可見分光光度法中的定性方法均可用于熒光分析法中。二、定量分析35根據(jù)Lambert-Beer定律：所以，（一）熒光強度與溶液濃度的關(guān)系36由于溶液的熒光強度與溶液對光的吸收程度及熒光效率成正比，即：當(dāng)abc≤0.05（即溶液很稀）時，對一定的熒光物質(zhì)的稀溶液（abc≤0.05），在一定的溫度下，當(dāng)激發(fā)光的波長、強度和液層厚度都固定后，其熒光強度與該溶液的濃度成正比。這是熒光分析定量的基礎(chǔ)。37（二）定量分析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：注：1.定量分析時通常依據(jù)激發(fā)光譜和熒光光譜，選擇λex和λem為測定波長2.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中濃度最高的調(diào)節(jié)儀器的熒光強度范圍高限，再分別測定其他濃度溶液的熒光強度，并減去空白溶液的熒光強度F0，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。38

2.直接比較法如果熒光物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線過零點，且線性良好，可用直接比較法測定。在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強度，進行比較：39第三節(jié)熒光分析儀器

instrumentof

fluorescenceanalysis

主要由5個部件組成：1.光源2.單色器3.樣品池4.檢測器5.記錄顯示裝置40I0ItF41激發(fā)光源:能夠在紫外-可見光區(qū)連續(xù)發(fā)光，有足夠的強度、適用波長范圍寬、穩(wěn)定。常用鹵鎢燈、氙燈、高壓汞燈或激光器燈.激發(fā)光源高壓汞燈：汞蒸汽放電發(fā)光

有365、405、436三條譜線

365nm最強

熒光計多采用汞燈為光源

一、儀器的主要部件42高壓氙燈一種短弧氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，光強度大。在200-800nm之間發(fā)射連續(xù)光。目前熒光分光光度計中應(yīng)用最為廣泛的一種光源。43分光系統(tǒng)兩個單色器激發(fā)單色器：位于光柵與樣品池之間，選擇激發(fā)光波長發(fā)射單色器：位于樣品池和檢測器之間，用于選擇熒光波長。發(fā)射單色器通常與激發(fā)光呈90度角（消除光源透過光的影響）樣品池采用石英材料四面均為磨光透明面僅有1cm厚度44紫外-可見分光光度計

測量池(吸收池)熒光分光光度計樣品池I0ItI0ItIF,p45通常采用光電倍增管檢測器的方向與激發(fā)光方向成直角。以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。檢測器46光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？47紫外-可見分光光度計:光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光分光光度計:光源樣