檢測血液葡萄糖的方法

檢測血液葡萄糖的方法

近年來，糖尿病患者的數(shù)量逐年增加。糖尿病主要表現(xiàn)為血液和尿液中葡萄糖含量的異常,目前的治療方式主要是對病人體內(nèi)的葡萄糖代謝進(jìn)行調(diào)控,臨床治療給藥的重要依據(jù)是病人的血液葡萄糖含量。目前醫(yī)院中最常用的方法是通過采集病人的血樣,處理后加入相關(guān)的化學(xué)試劑或酶試劑配置成溶液,反應(yīng)后用大型生化分析儀進(jìn)行分析檢測。這種方法優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確,缺點(diǎn)是檢測時間長、需要血液量多,需專業(yè)人員操作,不利于病人自我監(jiān)護(hù)。為了解決這一問題,同時也為醫(yī)院提供一種快速簡便的檢測輔助手段,作者開發(fā)出一種便攜式血糖儀,測量時只需一片試紙、6μl的血(全血),就可在50s的時間內(nèi)檢測出血糖濃度。1生色原的選擇目前比較流行酶法分析測定血液中葡萄糖的含量,其中用得最多的方法是葡萄糖氧化酶(GOD)—過氧化物酶(POD)比色法。其反應(yīng)原理是利用在GOD氧化葡萄糖時產(chǎn)生的H2O2,在POD存在時把還原型生色原氧化成氧化型生色原,其產(chǎn)量與血糖濃度成正比。生色原很多,如鄰聯(lián)茴香胺、鄰聯(lián)甲苯胺、3-甲基苯噻唑啉酮腙聯(lián)偶N,N-二甲基苯胺(簡稱MBTH-DMAB)、ABTs以及4-AA-酚等。綜合考慮,選用MBTH-DMAB做為生色原。葡萄糖氧化酶(GOD)——過氧化物酶(POD)聯(lián)偶分析法檢測葡萄糖的反應(yīng)式(1)如下:葡萄糖+O2+H2O?→?GODH2O2+O—葡萄糖酸(1)H2O2+DH2?→?POD2H2O+D(2)(氧化型生色原)(還原型生色原)葡萄糖+Ο2+Η2Ο→GΟDΗ2Ο2+Ο—葡萄糖酸(1)Η2Ο2+DΗ2→ΡΟD2Η2Ο+D(2)(氧化型生色原)(還原型生色原)在上述反應(yīng)中,MBTH-DMAB在反應(yīng)前為無色,反應(yīng)后為蘭色,在590nm附近光吸收強(qiáng)度變化靈敏。通過在此波長測量光的吸收強(qiáng)度,可計(jì)算出血液葡萄糖的濃度。2mbth-dmab法在醫(yī)院中,化驗(yàn)人員需按專門的操作規(guī)程操作生化分析儀,將參與反應(yīng)的酶或化學(xué)藥品配制成溶液,將分離出的血清與配制好的溶液按比例混合,然后放入儀器檢測。這種方法操作復(fù)雜,醫(yī)生或病人無法親自操作。將反應(yīng)(1)、(2)中的兩種酶通過固定化方法固定在尼龍66膜上,同時使生色原MBTH-DMAB吸附在同一膜上,使酶和染料在膜上均勻分布,并保持穩(wěn)定。測量時,將約6μl的血樣(全血)滴在尼龍66膜(已固定好酶和染料)的反應(yīng)區(qū),反應(yīng)生成物的顏色會在膜反應(yīng)區(qū)背面顯現(xiàn),用特定波長的光照射,反射光通過光電探測器接收。由于顏色的不同深度對光強(qiáng)的吸收不同,通過檢測反射光強(qiáng)度,可以確定血糖濃度。2.1光輻射作用下t選用發(fā)光波長在590nm附近的發(fā)光器件作為光源,發(fā)光強(qiáng)度通過電路控制,當(dāng)一定強(qiáng)度的光由膜反應(yīng)區(qū)反射至探測器接受面時,其強(qiáng)度(輻射通量)為:W=(W1α1?W2)α2(3)W=(W1α1-W2)α2(3)其中:W1發(fā)光器件輸出輻射通量W2反應(yīng)區(qū)吸收的輻射通量α1到達(dá)反應(yīng)區(qū)光輻射通量的比例α2反射回探測器光輻射通量的比例這時光電探測器在外電路中產(chǎn)生電流I為:I=Id?IΦ=Is(eqU/KT?1)?IΦ(4)Ι=Ιd-ΙΦ=Ιs(eqU/ΚΤ-1)-ΙΦ(4)其中:IS—探測器不受光照時的反向飽和電流IΦ—探測器光照下產(chǎn)生的光電流q—電子電荷U—外電路電壓K—波爾茲曼常數(shù)T—器件工作環(huán)境的絕對溫度如圖1所示,電流經(jīng)過電流電壓轉(zhuǎn)換、放大,再通過濾波器濾去干擾信號,然后送入單片機(jī),通過程序計(jì)算,得出血糖的濃度值。2.2葡萄糖氧化酶、過氧化物酶的生物吸附和物理包埋為了使血糖檢測儀操作簡單,便于病人自我監(jiān)測,選用固定化方法將酶以及生色原固定在特殊的載體上是必需的。根據(jù)WERNER以尼龍66為載體固定酶的原理,我們選用尼龍66做為載體,通過浸泡的方法將葡萄糖氧化酶、過氧化物酶以及MBTH-DMAB通過吸附及物理包埋原理固定在尼龍66上。固定時分兩步,第一步固定染料,第二步固定酶。具體操作如下:(1)由于MBTH-DMAB中有一種不溶于水,所以將MBTH-DMAB溶解于水和乙晴混合溶液,加入表面活性劑Triton-100,溶解均勻,將尼龍膜片放入浸泡,取出干燥,待用。(2)將葡萄糖氧化酶、過氧化物酶以一定比例溶解于pH=6.5的檸檬酸鈉緩沖液中,加入一定比例Triton-100和白蛋白,混合均勻,將浸泡過染料并干燥好的尼龍膜放入浸泡,取出烘干。將干燥后的膜剪成1厘米見方的小片即可使用。3結(jié)果和討論3.1覆蓋血糖及血糖等范圍本儀器測定全血葡萄糖濃度時,線形范圍為0.3～30mmol/L,覆蓋正常人血糖范圍3.7～6.1mmol/L以及低血糖、高血糖癥范圍。3.2回歸方程取醫(yī)院化驗(yàn)室血液樣品90例,做無糖化處理,加入不同量的葡萄糖使樣品濃度分布從0.3～30mmol/L,使用本儀器與大型生化分析儀同時測試,結(jié)果如圖2,回歸方程Y=1.0169X-3.275,相關(guān)系數(shù)R=0.9813。3.3初始梯度分辨率測量結(jié)果當(dāng)檢測高濃度血糖時,由于反應(yīng)結(jié)果的顏色過深,吸收光強(qiáng)過大,導(dǎo)致反射到探測器的光強(qiáng)變?nèi)?使測得的濃度梯度變得不明顯,因此在高濃度時梯度分辨率變低。如圖3所示。3.4討論(1)酶測試經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí),酶在固定化后,儲存期和使用壽命變長,在常溫下保存數(shù)月而性質(zhì)改變很小;對葡萄糖具有好的專一性,測得的是β-D葡萄糖。(2)測試結(jié)果可靠本儀器采用光學(xué)傳感器對生物信號進(jìn)行檢測,測試時間短(50s),需要樣品量少(6μl),測試結(jié)果可靠,測試范圍滿足臨床要求。適用于醫(yī)院及家庭自我監(jiān)控。(3)測量結(jié)果的偏移測試時環(huán)境的溫度及空氣的相對濕度對測量結(jié)果有影響。溫度的影響主要表現(xiàn)在兩個方面,一方面由于此方法采用速度法,在不同的溫度條件下,酶系的反應(yīng)速度不同,因此在所取時間點(diǎn)達(dá)到的反應(yīng)程度不同,導(dǎo)致對于相同濃度的血糖,反應(yīng)顏色不同,從而使測量結(jié)果發(fā)生偏移;另一方面,由于儀器的發(fā)光器件的發(fā)光強(qiáng)度隨溫度的升高而下降,而光電器件的輸出隨溫度的升高而升高,如不加以校正,也會影響測量結(jié)果。