免疫組化講課原理及方法

免疫組織化學技術的原理及方法1整理課件免疫組織化學技術的原理及其方法一.根本知識二.根本原理三.方法四.結果的判斷及異常著色原因分析和對策2整理課件一、免疫組化技術的根本知識3整理課件一、免疫組化技術的根本知識免疫組化的根本概念利用抗原-抗體特異性結合原理檢測抗原或抗體一般是用抗體檢測抗原抗原兩個主要屬性：免疫原性及特異反響性，蛋白質具有抗原性抗體與抗原能特異性結合—生物學結合是免疫球蛋白Ig4整理課件免疫球蛋白的化學結構及其模式圖

免疫球蛋白根據重鏈結構命名

IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)

五種免疫球蛋白只有兩種類型的輕連，即：

Kappa(κ)和Lambda(λ)

每個抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨的抗體分子決不可能既有κ鏈又有λ鏈。這一點在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。5整理課件免疫球蛋白的化學結構及其模式圖Fc(Fragmentcrystalline)

是免疫球蛋白的羧基端，意為結晶片段，因其純化時呈結晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關

Fab(Fragmentantigenbingding)

該端是抗體與抗原特異性結合的部位，每分子Ig能結合2個抗原分子

FcFabAg6整理課件多克隆抗體與單克隆抗體及其產生

多克隆抗體：多株B細胞針對多個抗原決定簇產生的抗體單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單株淋巴細胞〔克隆〕所產生的抗體多克隆抗體單克隆抗體7整理課件多克隆抗體與單克隆抗體及其產生多克隆抗體的產生以純化的抗原免疫動物而獲得，實際上是針對多個抗原決定簇的多個抗體組成，檢測范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的根本類型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產生，國外產品目錄上常以RaH〔RabbitagainstHuman〕表之。多克隆抗體亦可產生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動物來源種類，對后繼抗體的選用至關重要。8整理課件多克隆抗體與單克隆抗體及其產生單克隆抗體的產生應用細胞融合的雜交瘤技術〔Hybridization〕，以針對單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細胞〔腫瘤性B細胞〕融合形成雜交瘤，其特點是既能產生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內而獲單克隆抗體，由此產生的小鼠抗人〔抗原〕的抗體常以MaH表示，現(xiàn)在亦有兔的單克隆抗體9整理課件免疫小鼠Mouse10整理課件抗原的制備：傳統(tǒng)用蛋白提純近來可應用分子生物學技術：抗原的基因結構，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現(xiàn)有兔的單抗11整理課件多克隆抗體和多克隆抗體的選用單克隆抗體的制備比多克隆抗體復雜，價格更貴；在應用中不一定比多克隆抗體好。單克隆抗體的特異性強，多克隆抗體那么敏感性高，為何使用完全決定于使用的目的性12整理課件市售抗體的種類某些抗體既有多克隆抗體也有單克隆抗體，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗體，如α-胰蛋白酶有些抗體的抗原來自動物，利用動物與人抗原之間的共同抗原性使該種抗體能應用于人的檢測。如Desmin來源于雞的肌肉近年來,市售單克隆抗體除小鼠源性外，還有兔源性13整理課件標記抗體在抗體上用化學方法聯(lián)接某種標記物，目的是使抗原抗體的結合能用肉眼觀察到標記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明酶：辣根過氧化酶，鹼性磷酸酶金屬離子：膠體金顆粒標記的方法：化學性結合將降低抗體效價及標記物的活性，從而使染色敏感性降低14整理課件酶—

抗酶抗體復合物通過免疫反響而不是化學方法，將酶結合到抗體上，形成具酶活性的免疫復合物。如PAP復合物〔PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex〕，PAP復合物屬非標記性，保護了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍。15整理課件親和素—生物素復合物

〔Avidin-BiotinComplexABC〕親和素有四個生物素分子特異性結合部位，其結合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結合親和素-生物素復合物是一個三維空間的結構，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產生多級放大，從而提高此生物反響的敏感性和特異性AB復合物多用于ABC法的免疫組化中16整理課件酶標親和素〔Labelledstreptavidin〕在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此LSAB法比ABC法更敏感17整理課件多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結的由HRP標記的多聚物18整理課件一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

19整理課件二步法：EnVision20整理課件葡萄球菌蛋白A〔StaphylococcalproteinA,SPA〕21整理課件二、免疫過氧化物酶染色技術的根本原理22整理課件免疫過氧化酶染色技術的根本原理23整理課件識別系統(tǒng)特異性抗體識別組織或細胞中的靶抗原。特異性抗體具有識別并結合靶抗原的功能，這是本技術的理論依據所在特異性抗體品種繁多，應根據待檢測抗原的要求選用特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據不同染色要求而選用識別系統(tǒng)的組成比較恒定，識別功能由特異的第一抗完成24整理課件顯示系統(tǒng)也是顯色系統(tǒng)?？贵w抗原的結合是肉眼看不見的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反響變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標記位點形成有色分子的終末產物，假設顯色劑為DAB，那么出現(xiàn)棕褐色細顆粒沉淀E(酶)+S(底物)E?S(酶底物復合物)P(反響產物)+E(酶)循環(huán)使用25整理課件顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反響過程:HRP+H2O2HRP?H2O2有色分子終末產物+HRPDAB〔電子供體〕

HRP：酶H2O2：底物HRP?H2O2：酶?底物復合物

26整理課件免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標法：利用標記于橋聯(lián)抗體的酶PAP法：利用PAP復合物ABC法：利用AB復合物LSAB法:利用直接標記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統(tǒng)27整理課件聯(lián)結系統(tǒng)聯(lián)結或橋聯(lián)抗體〔一般為第二抗體〕按免疫學要求將識別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯(lián)結成為統(tǒng)一體應采用何種聯(lián)結抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。杭僭O一抗是多克隆抗體，那么二抗是羊或其它動物的抗兔血清；假設一抗是單克隆抗體，那么二抗常是兔抗鼠的血清有的聯(lián)結抗體既能聯(lián)結多抗，亦能聯(lián)結單抗28整理課件三、免疫組化染色方法的類別29整理課件免疫組化染色方法的類別直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法〔EPOS〕兩步法〔Envision〕30整理課件直接法將熒光、酶、金直接標記在一抗上進行顯色，沒有聯(lián)結系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標記31整理課件32整理課件間接法將標記物標記在橋聯(lián)抗體上〔即二抗、三抗〕一抗往往是兔身上產生的多克隆抗體，其酶標抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差33整理課件PrimaryAntibodySecondaryAntibodySubstrate-chromogenesolution34整理課件PAP法

〔Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法〕組成：一抗是針對靶抗原的特異性抗體二抗是聯(lián)結抗體，一面聯(lián)結一抗，另一面聯(lián)結PAP復合物三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復合物〔PAP〕35整理課件PAP法

〔Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法〕優(yōu)點：PAP復合物中含酶更多，且是一種非標記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復合物常來自兩種不同的動物〔鼠、兔〕，鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片36整理課件PAPPrimaryAntibodySecondaryAntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolution37整理課件ABC法

〔Avidin-BiotinComplex，親和素-生物素法〕組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復合物〔親和素+酶標生物素〕優(yōu)點：親和素和生物素有強大親和力，使其比直接和間接酶標法更敏感，也超過PAP法。能用于常規(guī)石蠟切片。38整理課件親和素—生物素復合物

〔Avidin-BiotinComplexABC〕親和素有四個生物素分子特異性結合部位，其結合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結合親和素-生物素復合物是一個三維空間的結構，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產生多級放大，從而提高此生物反響的敏感性和特異性AB復合物多用于ABC法的免疫組化中39整理課件ABC法

〔Avidin-BiotinComplex，親和素-生物素法〕40整理課件一抗二抗ABCDABABC41整理課件ABC與PAP法的比較42整理課件LSAB〔SP〕法

〔labelledstreptavidinbiotinmethod〕標記的鏈霉親和素-生物素法特點：將HRP直接標記于鏈霉親和素上優(yōu)點：更快速：空間結構更小更敏感：鏈霉親和素的親和性更強，更易于到達深部位點非特異背景更少：鏈霉親和素空間結構特殊，不易與高荷電的組織成分〔膠原纖維、結締組織〕聯(lián)結43整理課件酶標親和素〔Labelledstreptavidin〕在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此LSAB法比ABC法更敏感44整理課件SPPrimaryAntibodyBiotinylatedSecondaryAntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolution45整理課件ABC與LSAB(SP)法的比較46整理課件一步法〔EPOS〕及兩步法〔Envision〕特點以多聚體為載體，聯(lián)結了酶和一抗〔一步法〕或二抗的Fab段和酶〔二步法〕優(yōu)點操作簡便，省時提高了敏感性和特異性減少了背景著色防止內源性生物素的干擾47整理課件多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結的由HRP標記的多聚物48整理課件一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

49整理課件二步法：EnVision50整理課件一步法〔EPOS〕及兩步法〔Envision〕比較51整理課件Substrate-chromogensolutionEPOS一步法52整理課件PrimaryAntibodyPolymercomplexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法53整理課件四、免疫組化染色結果的判斷及異常著色的原因分析及其對策54整理課件特異性著色具備特點

特定的組織特定的定位特定的細胞特定的細胞內的部位分布上的不均一著色的不均一性著色強度的不均一顆粒性顯色：DAB顯色劑應為棕黃到棕褐色免疫組化染色結果的判斷55整理課件CK染色，結腸腺癌細胞膜特異性著色56整理課件Kappa胞漿著色57整理課件TdT染色，胞核著色58整理課件PR胞核著色59整理課件ER胞核著色60整理課件免疫組化染色結果的判斷對照的設置空白對照陽性對照吸收試驗對照替代對照自身對照61整理課件異常著色〔假陽性〕原因及對策異常著色原因內源酶及內源性生物素抗體本身原因切片制作不當沖洗不充分DAB顯色產生背景著色抗原的喪失抗原的遮蔽抗體試劑因素操作不當假陰性的原因62整