蛋白質(zhì)分析概述

蛋白質(zhì)分析概述

1編輯pptDNARNAProteinMetabolismGenome“Genomics〞Proteome“Proteomics〞Metabolome“Metabonomics〞Transcriptome“Transcriptomics〞生命科學(xué)的主要研究對(duì)象2編輯ppt基因組學(xué)基因組:一種生物體或個(gè)體細(xì)胞所具有的一套完整的基因及其調(diào)控序列。基因組學(xué)：研究基因組的結(jié)構(gòu)組成、時(shí)序表達(dá)模式和功能，并提供有關(guān)物種及其細(xì)胞功能的進(jìn)化信息。特點(diǎn)：細(xì)胞中全部基因及非編碼區(qū)的整體性考察和系統(tǒng)性研究。揭示基因與基因間的相互關(guān)系、基因與非編碼序列的關(guān)系、基因與基因組的關(guān)系。3編輯ppt轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組:廣義指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及非編碼RNA;狹義指所有mRNA的集合。轉(zhuǎn)錄組學(xué)：對(duì)轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生的事件及其相互關(guān)系和意義進(jìn)行整體研究的一門科學(xué)。4編輯ppt蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組:一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué):從整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的一門科學(xué)。研究目的:對(duì)細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的識(shí)別與定量化,確定它們的細(xì)胞內(nèi)外的定位、修飾、相互作用、活性及其功能。5編輯ppt蛋白質(zhì)組學(xué)分類表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(Expressionproteomics)又稱定量調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)〔quantitativeregulationproteomics),研究在整體水平上研究生物體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。細(xì)胞譜蛋白質(zhì)組學(xué)(Cell-mapproteomics)?又稱結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(structuralproteomics)，研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)行為、運(yùn)輸和相互作用。功能蛋白質(zhì)組學(xué)〔functionalproteomics)以特定時(shí)間、特定環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件下基因組活潑表達(dá)的蛋白質(zhì)研究對(duì)象。6編輯ppt相同點(diǎn):都屬于整體概念,蛋白質(zhì)組是基因組的反映，但不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物。不同點(diǎn):基因組:1.均一性和完整性2.非常穩(wěn)定，不易發(fā)生改變蛋白質(zhì)組:1.特殊性和多樣性2.可變性，高度動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的比較7編輯ppt代謝物組學(xué)代謝組：指某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有的低分子量代謝產(chǎn)物。代謝物組學(xué)：定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對(duì)內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學(xué)?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你什么可能會(huì)發(fā)生，而代謝組學(xué)那么告訴你什么確實(shí)發(fā)生了。8編輯ppt人類蛋白組數(shù)量9編輯ppt蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略窮盡法：采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，力圖查清生物體內(nèi)的一切蛋白。差異法：尋找和篩選有意義因素引起不同群體樣本間差異蛋白譜，揭示細(xì)胞對(duì)此因素的反響途徑、進(jìn)程與本質(zhì)，同時(shí)獲得對(duì)某些關(guān)鍵蛋白的認(rèn)識(shí)和功能分析。10編輯ppt蛋白質(zhì)組信息學(xué)整體框架11編輯ppt傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定基于1950年Edman提出的Edman降解法進(jìn)行氨基酸測(cè)序。1980年，Shimonishi等將質(zhì)譜和Edman降解法結(jié)合對(duì)肽段混合物進(jìn)行測(cè)序，并針對(duì)該方法開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的計(jì)算程序1984年，Sakurai等基于全面搜索模式〔窮舉法〕開(kāi)展了自動(dòng)化的從頭〔denovo〕肽段測(cè)序算法，一些改進(jìn)的算法也陸續(xù)出現(xiàn)，如局部法〔圖論法〕把質(zhì)譜峰轉(zhuǎn)化成質(zhì)譜圖中的節(jié)點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建最正確路徑尋找氨基酸序列，大大提高了從頭測(cè)序的效率上世紀(jì)80年代末，電噴霧電離〔ESI〕和基質(zhì)輔助激光解吸電離〔MADIL〕兩種“軟電離〞技術(shù)的出現(xiàn)，使得蛋白質(zhì)等生物大分子的質(zhì)譜鑒定成為可能。90年代以后，利用肽質(zhì)量指紋〔PMF〕、串聯(lián)質(zhì)譜〔MS/MS〕數(shù)據(jù)和序列標(biāo)簽法，搜索蛋白質(zhì)序列鑒定蛋白質(zhì)的算法和軟件相繼出現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到飛躍開(kāi)展。隨著國(guó)際人類基因組方案的完成，蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)逐漸完善，串聯(lián)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)，可以滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究高通量、自動(dòng)化的要求，成為人類蛋白質(zhì)組表達(dá)譜研究的重要方法之一。蛋白質(zhì)鑒定的開(kāi)展史12編輯ppt蛋白質(zhì)組研究的根本技術(shù)路線13編輯ppt凝膠電泳〔1DGel、2-DE)樣品別離色譜技術(shù)〔液相色譜、毛細(xì)管電泳〕14編輯ppt一維凝膠電泳〔1DGel〕15編輯ppt二維凝膠電泳〔2-DE〕16編輯ppt二維凝膠電泳〔2-DE〕17編輯ppt雙向熒光差異凝膠電泳18編輯ppt一次可別離上千種10～100kD分子量的蛋白質(zhì)2.高分辨率3.便于計(jì)算機(jī)分析處理-蛋白質(zhì)定位、等電點(diǎn)、分子量的鑒定-蛋白質(zhì)的定量-建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)-不同的圖譜可進(jìn)行比較和分析4.與分析鑒定方法相匹配-轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行N或C端的序列分析-直接進(jìn)行蛋白質(zhì)膠內(nèi)或膜上酶解與質(zhì)譜分析匹配。2-DE的優(yōu)點(diǎn)2-DE的缺點(diǎn)1.難以有效別離的蛋白質(zhì)：-極酸、極堿性蛋白質(zhì)-疏水性蛋白質(zhì)-極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)-低豐度蛋白質(zhì)2.膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難以與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。19編輯ppt凝膠電泳〔1DGel、2-DE)樣品別離色譜技術(shù)〔液相色譜、毛細(xì)管電泳〕20編輯ppt質(zhì)譜分析1.可以獲得樣品分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息2.高效、靈敏、準(zhǔn)確、自動(dòng)化、可同時(shí)分析多蛋白混合物3.已逐步取代了傳統(tǒng)的Edman降解測(cè)序與氨基酸組份分析法，成為蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)21編輯ppt22編輯ppt質(zhì)譜儀由進(jìn)樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等組成–電離裝置把樣品電離為離子–質(zhì)量分析裝置把不同質(zhì)荷比的離子分開(kāi)–經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)之后可以得到樣品的質(zhì)譜圖質(zhì)譜儀的功能模塊23編輯ppt質(zhì)量范圍：質(zhì)譜儀所檢測(cè)的單電荷離子的質(zhì)荷比范圍分辨率(R)：質(zhì)譜儀分開(kāi)相鄰兩離子質(zhì)量的能力。

R=m/

m

m為質(zhì)譜儀可分辨的相鄰兩峰的質(zhì)量差

m

為可分辨的相鄰兩峰的平均質(zhì)量質(zhì)量精確度：生物分析物質(zhì)量的測(cè)量值與實(shí)際分子量的接近程度(用百萬(wàn)分率表示，ppm)掃描速度:離子檢測(cè)速度即質(zhì)譜儀獲取數(shù)據(jù)的速度質(zhì)譜儀的主要技術(shù)指標(biāo)24編輯ppt25編輯ppt蛋白質(zhì)鑒定的技術(shù)流程圖樣品制備蛋白分離酶切肽段分離質(zhì)譜鑒定質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理過(guò)程數(shù)據(jù)庫(kù)搜索質(zhì)控和評(píng)估最終鑒定列表的獲得26編輯ppt肽質(zhì)量指紋譜〔PeptideMassFingerprint，PMF〕也稱一級(jí)質(zhì)譜–質(zhì)量精確度不夠，一般是對(duì)蛋白別離得較徹底的樣品，如2DE別離。肽碎片指紋譜〔PeptideFragmentFingerprint，PFF〕也稱二級(jí)質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜〔MS/MS〕–可以提供精確結(jié)構(gòu)信息，一般是對(duì)蛋白未別離或別離效果差的樣品。蛋白質(zhì)鑒定方法27編輯ppt一級(jí)質(zhì)譜〔PMF〕鑒定法--費(fèi)用低廉--所鑒定蛋白質(zhì)序列必須--不適用于3種蛋白以上的混合物--敏感性不夠，肽段缺失導(dǎo)致沒(méi)有結(jié)果--精確性不高--2DE中只有大約40%的點(diǎn)能得到鑒定28編輯ppt選擇某一質(zhì)荷比的肽段進(jìn)行MS/MS分析，將產(chǎn)生的碎片離子的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。串聯(lián)質(zhì)譜：肽段碎片離子鑒定29編輯ppt二級(jí)質(zhì)譜圖30編輯ppt質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程31編輯ppt蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件32編輯ppt串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件列表33編輯ppt16Nodesin-houseLinuxCluster,32XeonCPU,14.5TBstorageserver高性能集群計(jì)算機(jī)(HPC)HangzhouNationalsoftwarecenter,512CPU34編輯ppt多搜索引擎整合根本思路：將各搜索引擎的鑒定分值轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一的概率分值，得到整合的肽段鑒定概率。整合方法可采用選擇搜庫(kù)分值、特征參數(shù)、概率模型等。35編輯ppt36編輯ppt各環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)程序的制定從大規(guī)模數(shù)據(jù)產(chǎn)出走向數(shù)據(jù)挖掘蛋白質(zhì)鑒定從定性走向定量研究從根底發(fā)現(xiàn)逐步走向臨床蛋白質(zhì)組研究開(kāi)展趨勢(shì)37編輯ppt1.SWISS-PROT/TrEMBL://expasy.ch/sprot/2.ProteinInformationResource(PIR):///3.NCBInr://4.dbESTGenbank一個(gè)分支5.OWL://biochem.ucl.ac6.UniGene由NCBI提供蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)

38編輯ppt1.AAindex:〔氨基酸索引數(shù)據(jù)庫(kù)〕網(wǎng)址://genome.ad.jp/dbget/2.GELBANK://3.Predictome://4.ProteomeAnalysisDatabase://ebi.ac.uk/proteome/5.REBASE://rebase.neb/rebase/rebase.html6.SWISS-2DPAGE:///ch2d/7.YPL.d