均相免疫分析技術(shù)-Binding-Assay

均相免疫分析技術(shù)-BindingAssay目錄TR-FRET：時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移Time-resolvedFluorescenceResonanceEnergyTransferAlpha：放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssayTR-FRETTime-resolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移。該技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescenceResonanceEnergyTransfer）和時間分辨（TR，TimeResolved）兩種技術(shù)。FRET：熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET技術(shù)利用了兩種熒光基團的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團分別稱為能量供體(Donor，有銪或鋱兩種)和能量受體(Acceptor，有XL665或d2兩種)，

Donor的發(fā)射光譜與Acceptor的激發(fā)光譜重疊。Donor被外來能源激發(fā)后，其發(fā)射波譜在620nm處有一波峰，如果它與Acceptor在足夠近的距離之內(nèi)(10nm內(nèi))，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到Acceptor上。Acceptor受到激發(fā)，發(fā)出特定波長（665nm）的發(fā)射光。Donor發(fā)射光譜XL665激發(fā)和發(fā)射光譜虛線為激發(fā)光譜發(fā)射光譜為陰影部分FRET：熒光共振能量轉(zhuǎn)移將Donor和Acceptor分別偶聯(lián)在相互作用的兩個生物分子上，生物分子的結(jié)合可以將Donor和Acceptor拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。由于Acceptor分子的發(fā)射光來自于能量轉(zhuǎn)移，所以在實驗中無需將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，可實現(xiàn)均相檢測。發(fā)生FRET需要兩個條件：1、Donor的發(fā)射光譜與Acceptor的激發(fā)光譜重疊。2、

Donor與Acceptor之間距離必須在10nm內(nèi)。FRETDonorDonorAcceptorTR：時間分辨TR技術(shù)是利用稀土元素中鑭系元素銪(Eu)或鋱(Tb)的獨特性質(zhì)，其熒光比普通熒光持續(xù)時間更長。普通熒光的半衰期為納秒級（ns），鑭系元素的半衰期為毫秒級（ms）

，有6個數(shù)量級的差別。TR:時間分辨在檢測時，TR有一個時間延遲約100微秒，經(jīng)過這個時間延遲，普通熒光的信號幾乎為零。因此TR的背景非常低，反映樣品實際情況。TR-FRET：時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移Donorlong-live

fluorescence(ms)Acceptorshort-livefluorescence(whennotengagedinFRET)(ns)340nm665nmSpectralselectivityEu3+

orTb3+

cryptateXL665ord2TemporalselectivityTR-FRET優(yōu)勢將FRET的均相實驗方式和TRF的低背景特點融合在一起，使得TR-FRET技術(shù)擁有操作簡單、通量大、實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠、假陽性率較低的優(yōu)勢；采用雙波長檢測能夠顯著減少實驗體系的干擾，最終的信號與產(chǎn)物形成的量成比例。TR-FRET技術(shù)也可以取代大部分ELISA，因為TR-FRET具有同等的檢測范圍和檢測極限，而且更節(jié)省實驗時間，并且不需要洗板的步驟，所以該技術(shù)近年來已被應(yīng)用于抗體的活性檢測。TR-FRET舉例分享TR-FRET競爭法測定人源RANKL單抗拮抗RANKL與RANK結(jié)合活性。試劑選擇Anti-TagReagents

Europium

Terbium

XL665d2

Anti-GST(GSS11)

Anti-6HIS(HIS-1)

Anti-c-myc(9E10)

Anti-FLAG

(M2)

Anti-HA(HAS01)

AntiMBP

Anti-DNP

Anti-Immunoglobulin

Reagents

Europium XL665

Anti-humanIg

(&d2)

Anti-mouseIg

(&d2)

Anti-rabbitIg

ProteinA

AffinityReagents

EuropiumXL665

Streptavidin

(&Tb) (&d2)

LabelingkitsEuropium Lumi4?-Terbium d2

TR-FRET舉例分享TR-FRET競爭法測定抗體拮抗RANKL與RANK拮抗活性Donor：Streptavidin-Eu，重組人RANK標(biāo)記Biotin，重組人RANKL標(biāo)記上Acceptor，620nm和665nm檢測RANKL與RANK結(jié)合信號。加入梯度稀釋的Sample（抗體），抗體與RANKL結(jié)合，可拮抗FRET信號的產(chǎn)生。隨著抗體濃度的梯度增加，熒光信號呈現(xiàn)劑量曲線關(guān)系。加入抗體TR-FRET舉例分享TR-FRET競爭結(jié)合活性曲線圖譜檢測：340nm激發(fā)光分別讀取620nm和665nm熒光信號關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置為：Lagtime=50μs-150μs，

Integrationtime=200μs-400μs。擬合

DeltaF%vsconcentration的曲線數(shù)據(jù)處理：所得數(shù)據(jù)需要轉(zhuǎn)換成DeltaF%，DeltaF%的計算方法為：Ratio=Signal665nm/Signal620nmDeltaRatio=Sample(orSTD)Ratio-NCRatioDeltaF%=DeltaRatio/NCRatio*100NC為negativecontrol；EC50=C×[2(1/G)-1](1/B)TR-FRET缺陷分子間有效距離受限，不易檢測較低信號水平。利用供體微珠（Donorbeads）和受體微珠（Acceptorbeads）來檢測生物分子的相互作用，微珠表面覆蓋了一層水凝膠，作為生物連接的功能基團。供體微珠含有光敏劑-酞菁，在680nm的光照射后將它周圍環(huán)境中的氧分子轉(zhuǎn)化為高能活躍的氧狀態(tài)-單體氧。單體氧在其4μs的半衰期內(nèi)可在溶液中擴散高達(dá)200nm的距離。如果在該范圍內(nèi)存在受體微珠，單體氧再與鄰近的受體微珠上的二甲基噻吩化合物產(chǎn)生化學(xué)冷光反應(yīng)，產(chǎn)生冷光效應(yīng)(波長大約370nm)，繼而通過激發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終讓受體微珠在520-620nm產(chǎn)生熒光信號。如果兩種微珠的距離超過200nm，單體氧無法擴散到受體微珠，則不會有信號的產(chǎn)生。在680nm波長的激發(fā)下，每個供體微珠能夠釋放60,000單體氧每秒，產(chǎn)生非常高的信號放大。由于單體氧非常不穩(wěn)定，此反應(yīng)相當(dāng)快速僅4μs，加上供體微珠和受體微珠距離超過200nm，反應(yīng)隨之下降，所以只有抗原抗體分子結(jié)合才能觸發(fā)反應(yīng)，通過測定熒光量來反映抗體的活性。

Alpha—AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測AlphaALPHA技術(shù)包括AlphaLISA和AlphaScreen兩種檢測方法。兩種方法都使用同一種供體微珠，但使用不同的受體微珠。AlphaScreenbeadsSiNNNNNNNNOSiSiODonor:Phthalocyanine（酞菁）O2680nmDO1g2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2340-350nmAcceptorbeads檢測波長:520-620nmDonorbeads450-500nm1O2SignalAmplificationAlphaScreen受體微珠上包埋了三種染料：二甲基噻吩，蒽和紅熒烯。最終發(fā)光的熒光染料紅熒烯會在520-620nm的波段發(fā)出可檢測光。AlphaLISAbeadsSiNNNNNNNNOSiSiODonor:Phthalocyanine（酞菁）O2680nmDO1g2AlphaLISAbeads檢測波長:607-623nmDonorbeads1O2SignalAmplificationOSNOSNOO1DgO2OSNenergytransferOSNOO1DgO2Europium在AlphaLISA受體微珠中，蒽和紅熒烯被一種鑭系元素銪(Europium)螯合物替代。被激發(fā)的銪螯合物可以在615nm左右形成波段更窄的更強的可檢測光。該反應(yīng)的半衰期為0.3秒，可使用時間分辨的方法檢測。AlphaLISA和AlphaScreen發(fā)射光譜對比與AlphaScreen相比，AlphaLISA受體微珠的信號更強，受到介質(zhì)干擾更少。ALPHA優(yōu)勢：均相體系、快速、穩(wěn)定，避免了空間位阻影響生物分子的相互結(jié)合，適用于高通量篩選；具有非常高的靈敏性。信號的產(chǎn)生是一系列的串聯(lián)反應(yīng)，由于其供體微珠上含有高濃度的感光材料以及受體微珠上含有的高密度二甲基噻吩衍生物和熒光素，在680nm波長的激發(fā)下，每個供體微珠能夠釋放60,000單體氧每秒，產(chǎn)生非常高的信號放大。通過這種串聯(lián)放大反應(yīng)產(chǎn)生的強大信號，能夠檢測到高達(dá)亞皮摩爾級別的化合物活性；具有非常低的背景。長波長激發(fā)，短波長發(fā)射，不會有自發(fā)光熒光的干擾。檢測模式為時間分辨熒光，能夠消除幾乎所有的來自體系或者板子熒光背景，進(jìn)一步降低了背景，確保結(jié)果的真實性；具有高信噪比。由于其較高的信號值以及較低的背景值，所以具有很高的信噪比；ALPHA技術(shù)還具有靈活多變的實驗設(shè)計，其檢測的范圍既可以是低親和力的結(jié)合，也可以是強親和力的結(jié)合。無論是酶的活性實驗，還是受體配體反應(yīng)，第二信使水平的檢測，GPCR的功能研究，DNA，RNA，蛋白質(zhì)，多肽，糖類，小分子，大分子以及巨大結(jié)構(gòu)的復(fù)合物等等的復(fù)合物相互作用都可以通過ALPHA技術(shù)來檢測。絕大多數(shù)的ELISA實驗都可以輕松地轉(zhuǎn)換ALPHA技術(shù)實驗平臺。22Alpha舉例分享AlphaScreen競爭法測定人源PD1單抗拮抗PDL1與PD1結(jié)合活性試劑選擇AlphaScreen舉例分享StreptavidinDonor；NichelateAlphaScreenAcceptor；重組人PDL1標(biāo)記Biotin;His標(biāo)簽重組人PD1;檢測PDL1與PD1的結(jié)合信號。加入梯度稀釋的Sample（抗體），可拮抗熒光信號的產(chǎn)生，并且呈現(xiàn)劑量曲線關(guān)系。熒光信號對濃度擬合曲線，可得EC50，標(biāo)準(zhǔn)品EC50