ev61和ca16雙價滅活疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)h2類細胞細胞因子的變化

ev61和ca16雙價滅活疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)h2類細胞細胞因子的變化

手足疾?。╤fdd）是由病毒引起的腸球菌感染的腸道感染。主要是5歲以下的嬰兒，嚴重危及兒童健康。它已成為亞太地區(qū)的一個主要公共問題之一。腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CoxsackievirusA16,CA16)是引起HFMD的兩種主要病原體［1-3］。EV71首次于1969年在美國加利福尼亞州患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標本中分離獲得,于1974年被證實與HFMD相關(guān)［4］。臨床表現(xiàn)中除HFMD外,重癥患者可引起嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(CNS)及心肺功能衰竭等［5-6］。CA16首次于1951年在南非成功分離［7］,主要引起嬰幼兒手、足和口腔黏膜皰疹、咽峽炎等癥狀,少數(shù)患者出現(xiàn)心肌炎、無菌性腦膜炎等并發(fā)癥。由CA16感染引發(fā)的腦干腦炎、肺炎等致死性癥狀以及死亡病例也曾在美國、日本、中國臺灣和法國被報道［8］。EV71和CA16在日本、越南、新加坡、中國及中國臺灣和香港等國家和地區(qū)常出現(xiàn)交替或共同流行［8-9］,進一步增加了RNA病毒基因重組概率及混合感染的可能性,加大了控制HFMD流行的難度［10］。有研究顯示,EV71和CA16混合感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,病程加長、病情加重、危重病例比例增高［11］。因此僅研發(fā)EV71或CA16單價疫苗難以有效控制HFMD的暴發(fā)和流行,特別是應(yīng)對EV71疫苗上市后HFMD仍然持續(xù)流行的態(tài)勢,急需開展EV71與CA16雙價疫苗的研究。目前尚未見EV71和CA16雙價疫苗免疫原性的相關(guān)報道。1實驗試劑與材料1.1毒株及細胞EV71病毒EV71/523-07T株(C4基因型EV71標準病毒候選株,凍干品,批號:20101122)和橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)均由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司惠贈;CA16病毒G10株(A基因型),由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所惠贈。1.2原液及疫苗EV71疫苗原液,蛋白質(zhì)量濃度80μg/mL;CA16疫苗原液,蛋白質(zhì)量濃度57μg/mL。EV71和CA16雙價疫苗是由EV71原液與CA16原液按體積1∶1.4的比例混合,制備成EV71和CA16蛋白含量相等的原液,加入鋁佐劑,稀釋成1μg/(型·0.5mL·瓶)的劑量。EV71單價疫苗,含氫氧化鋁佐劑,蛋白含量1μg/(0.5mL·瓶)。CA16單價疫苗,含氫氧化鋁佐劑,蛋白含量1μg/(0.5mL·瓶)。上述制劑均由華蘭生物工程股份有限公司制備。1.3實驗動物SPF(無特殊病原)級BALB/c小鼠(H-2d),雌性,6~8周齡,購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心。1.4主要試劑LUMINEX液相芯片技術(shù)mouseIFN-γ、IL-2、4、5、6、10和TNF-α試劑盒,購自美國BIO-RAD公司。小鼠淋巴細胞分離液和無血清培養(yǎng)基,均購自北京達科為生物技術(shù)有限公司。MEM培養(yǎng)基,購自日本日水制藥株式會社。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。1.5實驗分組及免疫將BALB/c小鼠隨機分為7組,每組10只。單針EV71單價疫苗組以每只1μg/0.5mL免疫小鼠腹腔;單針CA16單價疫苗組以每只1μg/0.5mL免疫小鼠腹腔;單針雙價疫苗組以每只1μg/(型·0.5mL)免疫小鼠腹腔。兩針EV71單價疫苗組為兩次均以每只1μg/0.5mL免疫小鼠腹腔;兩針CA16單價疫苗組為兩次均以每只1μg/0.5mL免疫小鼠腹腔;兩針雙價疫苗組為兩次均以每只1μg/(型·0.5mL)免疫小鼠腹腔;對照組為每只小鼠注射0.5mL鋁佐劑。單針免疫的小鼠初次免疫后21d采血取脾,兩針免疫的小鼠初次免疫后14d加強免疫,加強免疫后7d采血取脾。1.6體外微量中和試驗檢測抗體水平將小鼠摘眼球采血,血清采用經(jīng)典體外微量中和試驗檢測中和抗體效價,詳見參考文獻。將免疫血清自1∶8開始進行2倍系列稀釋后,分別與100CCID50(Cellcultureinfectivedose50%,細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量)的EV71/523-07T或CA16/G10等體積混合,接種于96孔板中,置37℃中和2h后,加入濃度為(1~2)×105/mL的RD細胞懸液,置CO2培養(yǎng)箱中于35℃培養(yǎng)7d后,用顯微鏡觀察細胞病變(CPE),以能抑制50%細胞病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和抗體效價,并以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。每次試驗均設(shè)病毒回滴試驗,回滴結(jié)果為32~320CCID50/孔時,試驗方判為成立。檢測結(jié)果以中和效價≥8判為EV71或CA16中和抗體陽性。1.7小鼠脾單個核細胞(Mononuclearcell,MNC)的分離將小鼠摘眼球采血,處死,在無菌狀況下取小鼠脾臟于篩網(wǎng)中,滴加生理鹽水研磨,制備脾細胞懸液,用小鼠淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞,加入10mLRPMI1640培養(yǎng)液清洗2次,加入1mL無血清培養(yǎng)基,混勻,計數(shù)。1.8LUMINEX液相芯片技術(shù)檢測細胞因子采用LUMINEX液相芯片技術(shù)(Luminexliquidchiptechnolo-gy)檢測小鼠脾MNC分泌IFN-γ、IL-2、4、5、6、10以及TNF-α的水平。在96孔細胞培養(yǎng)板中,加入100μL濃度5×106個/mLMNC后,再加入刺激物100μL質(zhì)量濃度10μg/mLEV71原液或100μL質(zhì)量濃度10μg/mLCA16原液,于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h。400×g離心5min,收集上清液,按照LUMINEX試劑盒說明書檢測各細胞因子。試驗設(shè)培養(yǎng)基對照孔、空白對照孔和刀豆蛋白(ConA)對照孔。1.9統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間EV71中和抗體比較采用單因素方差分析,組間CA16中和抗體比較采用t檢驗。組間IFN-γ、IL-2、4、5、6、10以及TNF-α濃度比較均采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2雙價疫苗對ca18表達的影響2.1雙價疫苗與單價疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)EV71和CA16中和抗體水平的比較雙價疫苗單針免疫與EV71單價疫苗單針免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的EV71中和抗體GMT(幾何平均值)分別為118.8和84.0,雙價疫苗兩針免疫與EV71單價疫苗兩針免疫的GMT分別為159.5和156.8。雙價疫苗單針、兩針與單價疫苗單針、兩針免疫小鼠誘導(dǎo)的中和抗體水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。CA16中和抗體效價檢測結(jié)果顯示,雙價疫苗單針免疫與CA16單價疫苗單針免疫小鼠產(chǎn)生的CA16中和抗體效價均為陰性,兩針免疫時效價GMT相近,分別為30.0和26.9,統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。EV71和CA16抗原共同免疫時體液免疫無協(xié)同作用。2.2雙價疫苗可增強Th2類細胞因子以及炎癥因子對EV71抗原刺激的應(yīng)答水平采用LUMINEX方法檢測雙價疫苗與單價疫苗不同針次免疫后的小鼠脾MNC經(jīng)EV71抗原或CA16抗原刺激后分泌細胞因子的水平。結(jié)果(見圖1,c~g)顯示,在兩針免疫時,雙價疫苗免疫的小鼠脾MNC經(jīng)EV71抗原刺激,與EV71單價疫苗相比,Th2類細胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌水平都出現(xiàn)顯著增高(P=0.020,P=0.027,P=0.038,P=0.019),炎癥因子IL-6和TNF-α也都顯著增高(P=0.038,P=0.026),IFN-γ和IL-2(圖1,a~b)分泌水平則未見顯著改變,但在單針免疫時,上述細胞因子(圖1,a~g)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。雙價疫苗免疫與CA16單價疫苗相比(圖1,h~n),無論單針還是兩針免疫,CA16抗原刺激小鼠脾MNC分泌的細胞因子水平顯示差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另外,兩針免疫誘導(dǎo)的細胞因子分泌水平與單針免疫相比均有增高趨勢(圖1,a~n)。3ev21和ca13雙價疫苗的免疫效力HFMD主要由EV71和CA16病原體引起,其中EV71引起的重癥和死亡病例較高,該疫苗的研發(fā)也備受關(guān)注。目前中國有3個企業(yè)研制的EV71滅活疫苗已完成Ⅲ期臨床試驗,顯示該疫苗具有良好的安全性及保護效果［13-15］。中國臺灣和新加坡研制的EV71疫苗也相繼完成了Ⅰ期臨床并證實具有良好的安全性［16-17］。另有研究表明,CA16基因工程病毒樣顆粒(Virus-likeparticle,VLP)疫苗和全病毒滅活疫苗免疫動物誘導(dǎo)的中和抗體可在體內(nèi)和體外中和CA16病毒,可保護受CA16致死株病毒攻擊的乳鼠或小鼠［8］,顯示單價CA16疫苗研發(fā)具有可行性。有學(xué)者將EV71疫苗與市售脊髓灰質(zhì)炎、流感、白百破五價疫苗共同免疫小鼠,與EV71單價疫苗相比,產(chǎn)生的EV71中和抗體水平基本一致,揭示了EV71疫苗制成多價疫苗的可行性［18］,但目前未見EV71和CA16雙價疫苗免疫原性的報道。研究采用體外微量中和試驗和LUMINEX方法對EV71和CA16雙價疫苗的免疫原性進行評價。結(jié)果顯示雙價疫苗與EV71或CA16單價疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的EV71中和抗體、CA16中和抗體GMT相似。將EV71抗體應(yīng)答水平與已經(jīng)完成臨床研究的3個EV71滅活疫苗相比,EV71成品疫苗(臨床申報劑量)單針免疫小鼠,21d后血清GMT分別為51.5、46.8、115.4［19］,與研究的雙價疫苗和EV71單價疫苗單針免疫產(chǎn)生的EV71中和抗體水平相近。在CA16抗體應(yīng)答方面,Cai等［20］研究表明,β-丙內(nèi)酯滅活的CA16-SZ05和CA16-G08疫苗分別以2μg/劑兩針(次)免疫小鼠后可誘導(dǎo)中和抗體GMT為64~256,用1μg/劑CA16免疫小鼠的抗體應(yīng)答水平低于文獻報道,可能與免疫劑量或檢測方法不同有關(guān)?，F(xiàn)階段尚缺乏標準化的CA16中和抗體檢測方法,有研究顯示不同毒株對檢測結(jié)果具有顯著影響,使CA16中和抗體檢測難以進行橫向比較［21］。CA16中和抗體檢測的規(guī)范化已成為疫苗研發(fā)和免疫原性評價的主要瓶頸。在細胞免疫方面,LUMINEX細胞因子檢測結(jié)果顯示,雙價疫苗免疫小鼠后,脾MNC經(jīng)EV71抗原刺激誘導(dǎo)的Th2類細胞因子IL-4、5、6、10及炎癥因子TNF-α表達水平均顯著高于EV71單價疫苗,IFN-γ和IL-2水平均無顯著提高。另外,雙價疫苗和CA16單價疫苗免疫小鼠后,脾MNC經(jīng)CA16抗原刺激誘導(dǎo)的細胞因子應(yīng)答水平均無顯著性差異。提示雙價疫苗可增強小鼠對EV71抗原的Th2類細胞因子和炎癥因子的應(yīng)答反應(yīng),推測可能與總抗體應(yīng)答相關(guān),但在抗EV71病毒中的作用尚需進一步研究。EV71與CA16交