黑曲霉脂肪酶有機硅突變體的制備及其生物信息學(xué)分析

黑曲霉脂肪酶有機硅突變體的制備及其生物信息學(xué)分析

脂肪酶（ec3.1.3）也被稱為甘油三醇水解酶，它可以有效地將三醇水解酶分解為甘油和游離脂肪酸。脂肪酶活性中心的催化部位通常是由天冬氨酸或谷氨酸、絲氨酸和組氨酸組成的催化三聯(lián)體。通常情況下，大多數(shù)脂肪酶的活性中心都被一種稱為“蓋子”的結(jié)構(gòu)所覆蓋，阻止了底物與活性中心的直接結(jié)合。蓋子結(jié)構(gòu)具有多樣性，有的僅由1個單一的α-螺旋構(gòu)成，有的由2個α-螺旋構(gòu)成，還有的僅由1個Loop環(huán)構(gòu)成，少數(shù)脂肪酶無蓋子結(jié)構(gòu)。在油-水界面，脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出脂肪酶的活性中心，底物進入活性中心，脂肪酶的催化活性被激活。脂肪酶的催化活性在油水界面大幅度提高的現(xiàn)象稱為界面激活。受界面激活催化特性的影響，底物的團聚狀態(tài)一定程度上影響脂肪酶的催化效率。為了獲得不依賴界面激活的脂肪酶突變體，科研人員設(shè)計和構(gòu)建了一系列“無蓋型”或“開蓋型”脂肪酶突變體。根據(jù)已解析的枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis脂肪酶A和南極假絲酵母Candidaantarctica脂肪酶B的3D結(jié)構(gòu)，結(jié)合其催化特性，可以推測：具有“蓋子”結(jié)構(gòu)域和界面激活特性并不是鑒別脂肪酶和酯酶的恰當(dāng)標準，脂肪酶在沒有蓋子結(jié)構(gòu)域的情況下依然可以表現(xiàn)出催化活性。Miled等利用基因工程手段缺失人胃脂肪酶(Humanpancreaticlipase,HPL)的“蓋子”結(jié)構(gòu)域后獲得的脂肪酶突變體，其催化活性較野生型人胃脂肪酶顯著降低。此外，蓋子結(jié)構(gòu)域還與脂肪酶的其他酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)，如對映體選擇性、鏈長特異性和熱穩(wěn)定性等。正因為脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持其正常功能非常重要，因此利用基因工程手段構(gòu)建“開蓋型”脂肪酶突變體是十分必要的。Carrièr等利用人胃脂肪酶的蓋子結(jié)構(gòu)域置換豬胰脂肪酶(Guineapigpancreaticlipaserelatedprotein2,GPLRP2)對應(yīng)結(jié)構(gòu)域后獲得的豬胰脂肪酶突變體，其蓋子結(jié)構(gòu)具有永久開蓋型構(gòu)型，同時該突變體不再依賴油水界面激活。這一結(jié)果表明，脂肪酶具有的界面激活特性不僅與蓋子結(jié)構(gòu)域的存在有關(guān)，其他結(jié)構(gòu)因子(如：蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基等)對于穩(wěn)定蓋子構(gòu)型的開或關(guān)有著重要的作用。Brzozowski等報道疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyceslanuginosa脂肪酶中位于蓋子結(jié)構(gòu)域第一個鉸鏈區(qū)的Arg84對于觸發(fā)脂肪酶界面活性具有重要的作用。類似的實驗結(jié)果在米黑根毛霉Rhizomucormiehei脂肪酶中也得到了證實：位于該脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域第一個鉸鏈區(qū)的Ser84對觸發(fā)該脂肪酶界面活性也具有重要的作用。微生物脂肪酶和酯酶均屬于α/β水解酶折疊家族，均能催化酯鍵的斷裂，二者的三級結(jié)構(gòu)具有高度的相似性，但僅脂肪酶表現(xiàn)出界面激活的催化特性。在先前的工作中，我們對比了黑曲霉脂肪酶(Aspergillusnigerlipase,ANL)和黑曲霉阿魏酸酯酶一級結(jié)構(gòu)和3D結(jié)構(gòu)的異同。在一級結(jié)構(gòu)上，二者的氨基酸殘基序列相似性達36%；在3D結(jié)構(gòu)上，二者的蓋子結(jié)構(gòu)域存在顯著差異。在活性中心的上方，黑曲霉脂肪酶和黑曲霉阿魏酸酯酶均可形成一段α-螺旋，但黑曲霉阿魏酸酯酶該α-螺旋的位置較黑曲霉脂肪酶對應(yīng)結(jié)構(gòu)的位置而言，更遠離活性中心。我們預(yù)測這一結(jié)構(gòu)差異可能與二者的催化特性差異之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。進一步分析該α-螺旋兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列，我們預(yù)測位于ANL蓋子結(jié)構(gòu)域第一鉸鏈區(qū)的Ser84和第二鉸鏈區(qū)的Asp99對于蓋子結(jié)構(gòu)域的開或閉構(gòu)型可能發(fā)揮了決定性的作用。本實驗分別用黑曲霉阿魏酸酯酶多肽鏈中與黑曲霉脂肪酶的Ser84和Asp99相對應(yīng)的氨基酸殘基置換Ser84和Asp99，構(gòu)建2個黑曲霉脂肪酶突變體：ANL-Ser84Gly和ANL-Asp99Pro，并測定了這2個突變體的部分酶學(xué)性質(zhì)。1材料和方法1.1試劑和材料1.1.1pichiapastorisgs115及質(zhì)粒ppc9k-lipnl的合成克隆宿主EscherichiacoliDH5α，表達宿主PichiapastorisGS115及質(zhì)粒pPIC9K-lipanl均為本實驗室保存(lipanl為黑曲霉脂肪酶成熟肽的編碼基因序列)。1.1.2t4d-4-硝基苯羧酸酯高保真PfuDNA聚合酶購自Sangon生工生物工程(上海)有限公司；各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；系列4-硝基苯羧酸酯均購自Sigma公司；甲醇和甘油酯為市售分析純。1.2方法1.2.1pcr擴增條件及產(chǎn)物的擴增通過重疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)對黑曲霉脂肪酶基因進行定點突變，引入突變位點?；诋叧嘟湍该艽a子偏愛性設(shè)計的用于DNA定點突變的引物見表1。重疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)中使用的PCR引物、模板、PCR擴增條件及產(chǎn)物大小見表2。用EcoRⅠ和NotⅠ酶切PCR擴增獲得的引入突變位點后的lipanl全長基因，然后將其連接到經(jīng)同樣酶切后的pPIC9K上。重組pPIC9K-lipanl-S84G和pPIC9K-lipanl-D99P轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，DNA測序檢驗引入突變位點的正確性。1.2.2脂肪酶的純化P.pastorisGS115的轉(zhuǎn)化、脂肪酶基因的誘導(dǎo)表達和脂肪酶的純化均參照文獻。重組脂肪酶經(jīng)EndoglucosidaseH處理、SephadexG-75凝膠柱純化及凍干。重組黑曲霉脂肪酶蛋白質(zhì)濃度的測定參照Bradford法。1.2.3催化脂肪酶活力脂肪酶活性的平板定性檢測方法參照Hiol等的平板檢測方法，本實驗以三丁酸甘油酯作為脂肪酶活性的定性檢測底物。脂肪酶活性的分光光度計檢測法參照Kordel等的檢測方法，使用的緩沖液為0.05mol/LHis-HCl(pH6.5)，45℃進行測定。在該反應(yīng)條件下，每1min從對應(yīng)4-硝基苯羧酸酯上釋放出1μmol對硝基苯酚作為1個脂肪酶活力單位(U)。為檢測黑曲霉脂肪酶及其突變體界面激活效應(yīng)，參照Martinelle等所報道的方法，測定黑曲霉脂肪酶及其突變體水解不同濃度的4-硝基苯丁酸酯的催化活力曲線。水解溫度為25℃，使用的緩沖液為0.05mol/LHis-HCl(pH6.5)。1.2.4溫度對黑霉酶及其突變穩(wěn)定性的影響55℃下溫育黑曲霉脂肪酶及其突變體，在0～60min的不同時間間隔內(nèi)，分別檢測殘余脂肪酶酶活。將初始脂肪酶酶活定義為100%。2結(jié)果2.1黑曲霉脂肪酶高通量及重組菌的篩選微生物脂肪酶和酯酶具有相似的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，活性中心的催化位點均由Ser-His-Asp/Glu三聯(lián)體構(gòu)成。盡管脂肪酶和酯酶均能催化三酰甘油酯水解為脂肪酸和甘油，或是此反應(yīng)的逆向合成，但只有脂肪酶具有獨特的界面激活特性，而酯酶不具有此特性。在先前的研究中，我們對比了黑曲霉脂肪酶和黑曲霉阿魏酸酯酶的3D結(jié)構(gòu)，并且預(yù)測黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的鉸鏈區(qū)影響脂肪酶蓋子的構(gòu)型。進一步分析黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的氨基酸殘基序列和黑曲霉阿魏酸酯酶對應(yīng)的氨基酸殘基序列，篩選出黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的2個氨基酸殘基：Ser84和Asp99，對脂肪酶蓋子的構(gòu)型可能具有決定性的作用。為了驗證該預(yù)測，將黑曲霉脂肪酶中的Ser84和Asp99分別用黑曲霉阿魏酸酯酶中對應(yīng)的Gly和Pro殘基置換，構(gòu)建黑曲霉脂肪酶突變體ANL-S84G和ANL-D99P。利用表1中的引物對表2中的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后插入表達質(zhì)粒pPIC9K。重組質(zhì)粒pPIC9K-lipanl-S84G和pPIC9K-lipanl-D99P經(jīng)測序驗證閱讀框的正確性及突變位點氨基酸殘基的正確引入。突變氨基酸殘基引入位點對應(yīng)的堿基序列見圖1，測序結(jié)果表明在突變位點已成功引入置換的氨基酸殘基。2.2誘導(dǎo)表達的分子活性基因?qū)PIC9K-lipanl、pPIC9K-lipanl-S84G和pPIC9K-lipanl-D99P三個基因，分別導(dǎo)入到P.PastorisGS115表達菌株中進行誘導(dǎo)表達，獲得的重組脂肪酶具有相同的相對分子量，大約為35kDa(圖2A)。將20μL重組脂肪酶用三丁酸甘油酯平板定性檢測，在ANL、ANL-S84G和ANL-D99點樣區(qū)周圍，形成了清晰的水解圈(圖2B)。2.3anol-d29p的激活A(yù)NL-S84G和ANL-D99P表現(xiàn)出了和ANL明顯不同的底物特異性和熱穩(wěn)定性。水解系列4-硝基苯羧酸酯實驗結(jié)果表明：較ANL而言，ANL-S84G的比活力顯著降低，降低幅度從29.8%到76.5%不等；而ANL-D99P水解4-硝基苯棕櫚酸酯的比活力上升了2.2倍(表3)。ANL-S84G的比活力顯著降低可能是由于該突變導(dǎo)致重組脂肪酶ANL-S84G形成了相對穩(wěn)定的閉蓋構(gòu)型。Brzozowski等認為T.lanuginosa脂肪酶在閉蓋構(gòu)型狀態(tài)下，Arg84與Asp57可形成氫鍵。在油水界面，Arg84與結(jié)構(gòu)重排后的Cys268之間形成新的氫鍵，這一變化誘發(fā)了脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)的開啟，并激活了脂肪酶的活性。根據(jù)該假說可以推測，黑曲霉脂肪酶的Ser84與T.lanuginosa脂肪酶上的Arg84在脂肪酶分子中所處的位置相同，因此，在誘導(dǎo)脂肪酶構(gòu)型轉(zhuǎn)變過程中，發(fā)揮了類似的功能。黑曲霉脂肪酶上的Ser84被Gly置換后，這一過程破壞了氫鍵的形成并將導(dǎo)致ANL-S84G突變體形成相對穩(wěn)定的閉蓋構(gòu)型，在油水界面，ANL-S84G能形成有效激活構(gòu)型分子的比率將降低，ANL-S84G的比活力也因此降低。較ANL而言，ANL-D99P催化4-硝基苯棕櫚酸酯的比活力提高了2.2倍，而對4-硝基苯月桂酸酯和4-硝基苯肉豆蔻酸酯的比活力基本保持不變(表3)。黑曲霉脂肪酶上位于蓋子結(jié)構(gòu)域第二鉸鏈區(qū)的Asp99被Pro置換后形成的脂肪酶突變體，擴大了蓋子結(jié)構(gòu)的伸展空間，使其活性中心能容納更大的底物分子，因此，對長鏈脂肪酸酯的比活力有所提高。上述分析，理論上解釋了S84G和D99P的突變，增加了ANL-S84G與ANL-D99P蓋子結(jié)構(gòu)域及其兩側(cè)鉸鏈區(qū)的柔韌性，導(dǎo)致其催化活性的降低或提高。此外，S84G和D99P的突變，可能會破壞突變體ANL-S84G與ANL-D99P的二級結(jié)構(gòu)作用力，使突變體分子的二級結(jié)構(gòu)域更趨不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致了其熱穩(wěn)定性的顯著降低(圖3)。55℃下溫育15min,ANL-S84G和ANL-D99P分別失去了85.1%和94.0%的初始酶性，而ANL在相同情況下僅失去15.6%的初始酶活。S84G和D99P的突變，對脂肪酶活性和熱穩(wěn)定性影響的分子機制還有待進一步深入研究。2.44界面激活特性4-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate,pNPB)在水溶液中是部分可溶的，因此常用其作為研究脂肪酶界面激活的底物。為了將pNPB的自身水解控制在最小程度內(nèi)，本實驗中使用的緩沖溶液為His-HCl(pH6.5)。實驗結(jié)果表明，ANL和ANL-S84G表現(xiàn)出了明顯的界面激活效應(yīng)(圖4A和4B)，而ANL-D99P沒有表現(xiàn)出界面激活效應(yīng)(圖4C)。盡管ANL-S84G表現(xiàn)出界面激活效應(yīng)，但其水解的動力學(xué)曲線和ANL相比，存在明顯不同。正如上文所提到的，按照Brzozowski假說，ANL-S84G突變體的蓋子結(jié)構(gòu)應(yīng)該保持相對穩(wěn)定的“閉蓋”構(gòu)型，但實驗結(jié)果依然具有界面激活特性。因此，除了Arg84機制，ANL-S84G應(yīng)該還存在其他機制觸發(fā)蓋子結(jié)構(gòu)的開蓋。D99P位點的突變可能改變了ANL-D99P蓋子結(jié)構(gòu)域第二鉸鏈區(qū)的β折疊的相對位置，從而產(chǎn)生了不依賴于油水界面激活的催化特性。3脂肪酶因子激活為了獲得不依賴界面激活的脂肪酶突變體，先前開展了大量探索性工作，基本都集中在對組成蓋子結(jié)構(gòu)本身的氨基酸殘基進行突變。Miled等通過缺失蓋子結(jié)構(gòu)域的方法獲得的人胃脂肪酶突變體，其催化動力學(xué)雖然較天然脂肪酶分子表現(xiàn)出明顯的差異，但并沒有獲得預(yù)期的開蓋型突變體分子。Carrièr等則通過脂肪酶分子之間相互置換蓋子結(jié)構(gòu)域，獲得永久開蓋的豬胰脂肪酶突變體。本實驗則通過蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)與功能之間的對應(yīng)關(guān)系，建立起脂肪酶與酯酶催化特性的差異性與對應(yīng)結(jié)構(gòu)的差異性之間的聯(lián)系，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，對黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基進行突變，獲得了一