中藥當(dāng)歸提取物抗皮膚衰老能力和美白功效的實(shí)驗(yàn)研究

中藥當(dāng)歸提取物抗皮膚衰老能力和美白功效的實(shí)驗(yàn)研究

皮膚磨損是人體身體的自然發(fā)展規(guī)律。隨著對皮膚衰老機(jī)理的深入研究,人們不斷的研究和總結(jié)預(yù)防和延緩皮膚衰老的有效途徑和方法。中草藥因其獨(dú)特機(jī)理和美容效果已被廣泛應(yīng)用于護(hù)膚類化妝品中。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根,是臨床常用藥,素有“十方九歸”之稱。性味甘、辛、溫,歸肝、心、脾經(jīng)。內(nèi)服有補(bǔ)血活血,調(diào)經(jīng)止痛,潤腸通便的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸還具有抗炎、清除氧自由基、增強(qiáng)免疫功能等作用。動物實(shí)驗(yàn)研究已表明含復(fù)方當(dāng)歸提取物水劑型護(hù)膚品具有增加小鼠表皮含水量和提高小鼠皮膚細(xì)胞SOD活性;人體試驗(yàn)研究顯示它具有改善人體皮膚顏色,增加皮膚白皙、透明效果。這些新的功效在護(hù)膚化妝品研發(fā)當(dāng)中得到了重視和應(yīng)用。本研究主要通過體外實(shí)驗(yàn),從自由基捕捉效應(yīng)、絡(luò)合亞鐵離子能力及酪氨酸酶活性抑制三方面對當(dāng)歸提取物抗皮膚老化與美白能力進(jìn)行評估,并對體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)和佐證。1hyratchlra高效酶當(dāng)歸購自廣州市清平藥材市場,經(jīng)廣東省中藥研究所藥物研究室鑒定。DPPH(1,1-diphenyl-2-2-picrylhydrazylradical)、菲咯嗪(5mmol/L)、酪氨酸酶(用PBS配制成相應(yīng)濃度單位)均為sigma公司生產(chǎn)。甲醇、FeCl2·4H2O(2mmol/L)、熊果苷,EDTA,VitE,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純,配制水均為雙蒸水。752型紫外分光光度計,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,恒溫水浴鍋,真空減壓泵、中藥粉碎機(jī)、離心機(jī)。2方法2.1中藥提取2.1.1浸提液的選擇當(dāng)歸100g→破碎→烘干(80℃)→粉碎(40目)→用雙蒸水浸提(分3次進(jìn)行,3次加水量分別是當(dāng)歸重的10,6,4倍;每次浸提溫度為100℃,時間30min)→合并3次浸提液→離心(1500r/min,30min)→濾液→離心(10000r/min,15min)→濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→當(dāng)歸濃縮液→定容。取定容液配制成0.5%,1.0%,2.0%等3種不同濃度。2.1.2采用“2.1.1”法，將提取物溶液調(diào)整為50%乙醇或95%乙醇，方法與“2.1.1”相同2.2抗疲勞試驗(yàn)2.2.1自由基清除率測定DPPH為含有奇數(shù)電子的穩(wěn)定自由基,本方法的原理是利用其甲醇溶液在517nm可見光下具有極強(qiáng)的吸光度,但當(dāng)其與任一自由基結(jié)合或被抗氧化劑還原時,其吸光度會下降;吸光度越低,表示樣品清除DPPH的能力越強(qiáng)。取0.2ml萃取物、3.8ml甲醇溶液與1ml(DPPH)radical甲醇溶液(2×10-4mol/L),充分混和均勻,靜置30min后,以分光光度計測517nm處吸光度,并以公式計算其自由基清除率。自由基清除率(%)=[(Ac-As/Ac)]×100%As:含有待測物的樣品在517nm處的吸光度;Ac:不含待測物的樣品在517nm處的吸光度。2.2.2絡(luò)合fe2+1+1asac絡(luò)合物的絡(luò)合能力計算Fe2+通常為較好的促氧化劑,可以促使脂質(zhì)氧化作用的進(jìn)行。本方法利用Fe2+與Ferrozine(菲咯嗪)的復(fù)合物在562nm處有呈色反應(yīng),可測得樣品對Fe2+的絡(luò)合能力。當(dāng)樣品絡(luò)合Fe2+會造成吸光度降低,吸光度越高表示絡(luò)合能力越好。絡(luò)合率(%)=[1?AsAc]×100%(%)=[1-AsAc]×100%As:含有待測物的樣品在562nm處的吸光度;Ac:不含待測物的樣品在562nm處的吸光度。取不同濃度的萃取液加入0.1ml的FeCl2·4H2O(2mmol/L)30s后再加入0.2mlFerrozine(5mmol/L),反應(yīng)10min后,使用分光光度計檢測吸光度,空白試驗(yàn)(Blank)以樣品溶劑取代樣品。2.3美白效果試驗(yàn)-當(dāng)歸提取物對酪氨酸酶活性的影響2.3.1酪氨酸酶檢測肌肉中b探討不同萃取物對抑制酪氨酸酶形成Dopaquinone的能力,并以維生素E(VitE)作對照組。取1ml的中藥萃取液,加入0.9mlpH6.8的緩沖液及1ml0.03%的酪氨酸溶液于試管中混和,并置于37℃的恒溫槽中10min,再加入0.1ml的酪氨酸酶(350units/ml)水溶液,將溶液混和均勻,置于恒溫槽中反應(yīng)25min后,以紫外分光光度計測定475nm時的吸光度(B)。2.3.2白色組步驟與處理組相同,但以等體積的磷酸緩沖液取代酪氨酸酶溶液(B0)。2.3.3對照組步驟與處理組相同,但以等體積萃取液所使用的溶劑取代萃取液(A)。2.3.4抑制率的測定步驟與處理組相同,但以等體積萃取液所使用的溶劑取代萃取液,以等體積的磷酸緩沖液取代酪氨酸酶溶液(A0)。抑制率(%)=(A?A0)?(B?B0)(A?A0)×100%(%)=(A-A0)-(B-B0)(A-A0)×100%A:處理組樣品在475nm處的吸光度;A0:空白組樣品在475nm處的吸光度;B:對照組樣品在475nm處的吸光度;B0:總空白組樣品在475nm處的吸光度。3結(jié)果與討論3.1中藥提取物的抗逆性和抗逆性的評價3.1.1清除dpph自由基的能力自由基是生命活動過程中生物化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物。在正常情況下,機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡之中,但它若在體內(nèi)產(chǎn)生過多或清除過慢,就會在分子水平、細(xì)胞水平以及器官水平給機(jī)體造成損傷,并可加快機(jī)體的衰老過程。與生命老化有關(guān)的生物自由基主要是一些含氧的自由基,如活性氧自由基(O2-·)、過氧化氫自由基(HO2·)、羥基自由基(·OH)等?？寡趸瘎┛商峁┵|(zhì)子給過氧化物自由基,因而能夠抑制脂質(zhì)自氧化的連鎖反應(yīng)。(DPPH·+AH(抗氧化劑)→DPPH+HA·)通常使用DPPH·(C18H12N6O5)來檢驗(yàn)抗氧化劑提供質(zhì)子的能力。DPPH·是一種很穩(wěn)定的自由基,其甲醇溶液在517nm處有極強(qiáng)的吸光度,但當(dāng)被氧化劑(AH)或自由基(R·)還原時,其吸光度會降低或消失。由此,可利用樣品在517nm處的吸光度來判定樣品是否有清除自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)以純水、50%乙醇、95%乙醇萃取當(dāng)歸,以VitE做參照,比較不同濃度的提取液清除DPPH自由基的能力。見圖1,以純水萃取時,萃取液濃度低時清除自由基的能力反而較好,2%濃度不但沒有清除效果反而有促進(jìn)自由基生成作用;50%乙醇和95%乙醇萃取時,萃取液濃度越高清除自由基能力越強(qiáng)。萃取的2%濃度當(dāng)歸以50%乙醇提取物自由基清除率可達(dá)到80.2%。水提與醇提組的結(jié)果正好相反。推測原因可能是因?yàn)楫?dāng)歸中的清除自由基有效成分在極性溶劑中溶出較多,所以實(shí)踐中最好采用醇提方式,50%乙醇的提取液優(yōu)于95%乙醇提取液清除自由基效果。3.1.2萃取物的氧化作用金屬離子在自由基連鎖反應(yīng)中具有促進(jìn)脂質(zhì)氧化的作用,通常與Fenton反應(yīng)及Harber-Weiss反應(yīng)有關(guān)。絡(luò)合劑沒有抗氧化能力,但有一對未共用電子對,可與過渡金屬(Fe2+,Cu2+)結(jié)合,因而能夠減少氧化反應(yīng)進(jìn)行。如萃取物中含有絡(luò)合亞鐵離子的成分,就可減少紫外線照射皮膚所引起的自由基生成反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以純水、50%乙醇、95%乙醇萃取當(dāng)歸,以EDTA做參照,比較不同濃度的提取液絡(luò)合亞鐵離子的能力。見圖2,當(dāng)歸提取物具有絡(luò)合亞鐵離子的能力;不同溶劑萃取的各種濃度萃取液,在較高濃度時有較好的絡(luò)合能力,其中以50%乙醇萃取的2%濃度當(dāng)歸提取物絡(luò)合能力最強(qiáng),絡(luò)合率為41.4%。3.2不同濃度的乙醇、乙醇萃取對酪氨酸酶活性的影響黑色素的形成過程中,酪氨酸酶起了關(guān)鍵酶的作用,黑色素產(chǎn)生的多少與酪氨酸酶的活性有直接的關(guān)系。因此,皮膚美白劑就是通過作用于皮膚黑色素生成,代謝過程中,抑制黑色素生成且符合安全規(guī)范的物質(zhì)。由于酪氨酸酶分別作用于酪氨酸轉(zhuǎn)化為DoPa和Dopaquinone兩個過程,目前的皮膚美白劑就是通過抑制酪氨酸酶活性或者阻斷酪氨酸生成黑色素的氧化途徑,從而減少黑色素的生成達(dá)到美白皮膚的效果。本實(shí)驗(yàn)以純水、50%乙醇、95%乙醇萃取當(dāng)歸,以熊果苷做參照,在37℃、pH6.8的條件下反應(yīng)30min比較不同濃度的提取液抑制酪氨酸酶活性能力。見圖3,當(dāng)歸水提液抑制酪氨酸酶活性較低,甚至在較高濃度時有激活作用。醇提液具有抑制酪氨酸酶活性作用,并均表現(xiàn)為濃度高時有較高的抑制效果。水提液與醇提液酪氨酸酶抑制與激活能力的不同,同樣可考慮為對酶氨酸酶有抑制作