藻類類胡蘿卜素測(cè)定方法的研究進(jìn)展

藻類類胡蘿卜素測(cè)定方法的研究進(jìn)展

藻類獨(dú)特的色素是綠葉草、葉黃素和胡蘿卜。在所有浮游生物中，三種葉色a、b和c是所有浮游生物的1.2%。這是評(píng)價(jià)藻類生物量的良好指標(biāo)。細(xì)胞中的維生素含量因物種和群體而異，而且還受到年齡、生長(zhǎng)、光和養(yǎng)分條件的影響。脫鎂葉綠素a(一種葉綠素a的普通降解產(chǎn)物)能夠干擾葉綠素a的測(cè)定,因?yàn)槿绻嬖诿撴V葉綠素a,它能在葉綠素a的相同光譜區(qū)吸收光和熒光,造成葉綠素a值的誤差.當(dāng)測(cè)定葉綠素a的時(shí)候還要測(cè)定脫鎂葉綠素a.葉綠素a和脫鎂葉綠素a之比可作為浮游植物生理?xiàng)l件的一個(gè)良好指標(biāo).本文綜述了用分光光度法,熒光檢測(cè)法及高效液相色譜法測(cè)定藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的方法:(1)葉綠素a,b和c的分光光度法測(cè)定(三色法);(2)葉綠素a的熒光檢測(cè)法;(3)存在脫鎂葉綠素a時(shí),葉綠素a的分光光度法測(cè)定;(4)存在脫鎂葉綠素a時(shí)葉綠素a的熒光法測(cè)定;(5)高效液相色譜測(cè)定藻類的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物;(6)HPLC測(cè)定藻類葉綠素及類胡蘿卜素.1萃取物的光度計(jì)檢測(cè)用丙酮水溶液自浮游生物濃縮樣萃取色素,用分光光度計(jì)測(cè)定萃取物的吸光度.葉綠素自細(xì)胞內(nèi)提出的難度,不同藻類差異相當(dāng)大.為了將色素完全萃出,通常需要用組織研磨器機(jī)械的破壞細(xì)胞.1.1研磨控制和過濾系統(tǒng)(1)分光光度計(jì):用窄帶的(0.5~2.0nm).(2)1cm,4cm和10cm光程的比色池.(3)醫(yī)用離心機(jī).(4)組織研磨器(最好使用圓底的研磨管和搗桿).(5)離心管:15ml,有刻度和螺帽.(6)過濾設(shè)備:過濾器,濾膜(0.45μm孔徑,47mm直徑)或玻璃纖維過濾器(GF/C或GF/A,4.5cm直徑),真空泵.(7)MgCO3懸浮液:在100ml蒸餾水中加入1.0g細(xì)粉末MgCO3.(8)90%(體積比)丙酮水溶液.1.2萃取液的制備(1)離心或過濾濃縮水樣.在離心前或過濾的最后一步加入0.2mlMgCO3懸浮液.(2)把樣品置入組織研磨器,用2~3ml90%丙酮水溶液覆蓋浸泡.(3)把樣品移入一個(gè)有螺帽的離心管,用幾毫升90%丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液中,用90%丙酮水溶液調(diào)節(jié)體積到5~10ml.(4)在蓋緊的離心管中于500g離心20min澄清萃取液,把澄清的萃取液傾入一支清潔的,標(biāo)定過的15ml有螺帽的離心管并測(cè)定萃取液的總體積.(5)把萃取液移入1cm的比色池,在750、663、645和630nm測(cè)定吸光度(OD).1.3葉綠素amg/l、cmg/l、葉綠素bmg/l、葉綠素bmg/l、cmg/l、葉綠素bmg/l、k.cmg/l、k.cmg/l、k.cmg/l、k.cmg/l、k6.0.3.2和k-lod60的計(jì)算葉綠素a,b和c的測(cè)定分別使用663、645和630nm的吸光度.750nm的讀數(shù)用來校正渾濁度.將每個(gè)色素的OD值中減去這個(gè)渾濁度校正值后,帶入下列公式計(jì)算濃度:(1)葉綠素a(mg/l)=11.64(OD663)-2.16(OD645)+0.10(OD630)葉綠素b(mg/l)=20.97(OD645)-3.94(OD663)-3.66(OD630)葉綠素c(mg/l)=54.22(OD630)-14.18(OD645)-5.53(OD663)(2)各單位體積色素量的計(jì)算如下:葉綠素a(mg/m3)=葉綠素a(mg/l)×萃取液的總體積(l)/水樣體積(m3)2最佳靈感度的測(cè)定和分光光度法葉綠素a的熒光檢測(cè)法比分光光度法靈敏,需樣品較少.而且不要求像分光光度法那樣的波長(zhǎng)分辨率,在430nm的激發(fā)波長(zhǎng)和在663nm的發(fā)射波長(zhǎng)抽取在試管內(nèi)測(cè)定葉綠素a可過的最佳靈感度.2.1增管r-133紅敏(1)熒光計(jì),備有高強(qiáng)度F4T.5藍(lán)光燈,光電倍增管R-136(紅敏),可滑動(dòng)窗孔,光發(fā)射(CS-2-64)和光激發(fā)(CS-5-60)濾光片,以及一個(gè)高靈敏度門.(2)其他設(shè)備和試劑同1.12.2u3000葉綠素a濃度的測(cè)定(1)用已知濃度的葉綠素溶液標(biāo)定熒光計(jì):用分光光度法測(cè)定濃度約為2、6、20和60μg/l的葉綠素a萃取液,再在每一靈敏度位置對(duì)每一溶液進(jìn)行讀數(shù),導(dǎo)出標(biāo)定系數(shù)FsFs=Ca/Rs式中Fs——靈敏度位置S的標(biāo)定系數(shù)Rs——靈敏度位置S的熒光計(jì)讀數(shù)Ca——分光光度法測(cè)定的葉綠素a濃度(μg/l)(2)在能夠取得適中讀數(shù)的各靈敏度位置測(cè)定樣品的熒光,將讀數(shù)乘以適當(dāng)?shù)臉?biāo)定系數(shù),得到葉綠素a濃度.3葉綠素a含量的測(cè)定由于脫鎂葉綠素在接近葉綠素a相同的波長(zhǎng)上有吸收,因而含有脫鎂葉綠素時(shí)葉綠素a的測(cè)定值可能偏高.葉綠素a由于酸化作用變成脫鎂葉綠素a,吸收峰的值比原來大約降低40%,并從663nm移至665nm,酸化前后產(chǎn)生的吸收峰之比為1.70,可用來表觀葉綠素a的濃度作脫鎂葉綠素a的校正.3.1儀器和試劑(1)同1.1(2)HCl1mol·L-13.2od.5值的提取(1)用90%丙酮水溶液萃取色素,離心澄清,在750、663nm讀取OD值.(2)在1cm的比色池中用兩滴1mol·L-1HCl酸化萃取液,輕輕攪拌1~2min后在750、665nm讀取OD值.(3)酸化前OD663和酸化后OD665值都減去OD750值.3.3萃取溶劑pvb/3ga使用校正過的值計(jì)算葉綠素a濃度(C)與脫鎂葉綠素a濃度(P)C(mg/m3)=26.73(663b-665a)V1/V2LP(mg/m3)=26.73[1.7(665a)-663b]V1/V2L式中V1——萃取液的體積(l)V2——水樣的體積(m3)L——比色皿液層厚度(cm)663b,665a分別為酸化前后90%丙酮水溶液萃取的吸光度.26.73是吸光度校正4脫鎂葉綠素a濃度的測(cè)定用熒光法測(cè)定脫鎂葉綠素a的濃度,需要測(cè)定酸化前后丙酮萃取液的熒光.葉綠素a由于酸化后變成脫鎂葉綠素a,致使熒光降低,利用這一原理進(jìn)行測(cè)定萃取液的脫鎂葉綠素a濃度.4.1儀器和試劑(1)同2.a(2)HCl1mol·L-1(3)純?nèi)~綠素a4.2熒光比的計(jì)算校準(zhǔn)熒光計(jì),在每一靈敏度位置測(cè)定酸化前后萃取液的熒光.計(jì)算校準(zhǔn)系數(shù)(Fs),用酸化前的熒光讀數(shù)除以酸化后的熒光讀數(shù),算出酸化前后的熒光比.4.3計(jì)算式中Fs——靈敏度位置S的換算系數(shù)Rb——萃取液酸化前的熒光Ra——萃取液酸化后的熒光r——Rb/Ra5在高效液相層析條件下，測(cè)定了藻類的葉色和產(chǎn)物5.1熒光檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)物的制備除色素提取物外還包括:(1)高效液相色譜儀,流速為2.0ml/m.(2)裝有100微升進(jìn)樣環(huán)管的高壓進(jìn)樣閥.(3)保護(hù)柱(4.0*0.5cm,C18,3μm)(4)反相HPLC柱(C18,10cm,3μm)(5)熒光檢測(cè)器,波長(zhǎng)為430±30nm,可發(fā)射超過600nm熒光.(6)數(shù)據(jù)紀(jì)錄裝置,長(zhǎng)條紙記錄器或電子積分儀.(7)注射器,玻璃,250μL(8)HPLC洗脫劑:洗脫劑A(80∶15∶5;甲醇∶Ⅰ型試劑∶離子對(duì)溶液),洗脫劑B(80∶20;甲醇∶丙酮).(9)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物:分別將1ml純?nèi)~綠素a和b溶于100ml90%丙酮中,用分光光度法測(cè)定其準(zhǔn)確濃度.用上述葉綠素a和b標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)鹽酸酸化后制得脫鎂葉綠素a+a′和b+b′標(biāo)準(zhǔn)物;從硅藻中萃取葉綠素c和脫植基葉綠素a,酸化脫植基葉綠素a制得脫鎂葉綠素酸a,分別用薄層色譜法(TLC)純化,分光光度法校準(zhǔn),作為標(biāo)準(zhǔn)物.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限(1)用洗脫劑A,流速為2.0ml/m,建立和平衡HPLC系統(tǒng);校準(zhǔn)熒光計(jì)的感光度,用葉綠素a標(biāo)樣的濃度最大值作為滿刻度.(2)通過先前制備的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)的工作標(biāo)準(zhǔn).分別混合葉綠素與脫植基葉綠素a,脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素酸a,作為混合標(biāo)準(zhǔn)物.混合1ml標(biāo)準(zhǔn)液與300μL離子對(duì)溶液,平衡5分鐘后進(jìn)樣.混合1ml90%丙酮與300μL離子對(duì)溶液作為空白液.用150μL標(biāo)準(zhǔn)液漂洗注射器2次,注射器中吸入250μL標(biāo)準(zhǔn)液用于進(jìn)樣,將注射器插入進(jìn)樣閥,充滿100μL的進(jìn)樣環(huán)管.建立標(biāo)準(zhǔn)色素濃度與熒光峰面積(或高)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.(3)混合1ml90%丙酮色素提取物與300μL離子對(duì)溶液,作為進(jìn)樣樣品.(4)使用兩步溶劑程序,用于優(yōu)化葉綠素及其降解產(chǎn)物的分離.進(jìn)樣后,5分鐘內(nèi)將洗脫劑A轉(zhuǎn)變?yōu)橄疵搫〣,維持B15分鐘,流速為2.0ml/m.在下一次進(jìn)樣前,需用洗脫劑A重新平衡色譜柱5分鐘.總分析時(shí)間約為25分鐘.(5)用下列公式計(jì)算各色素的濃度Ci=AsFiVe/VEVs式中Ci=各色素的濃度mg/lAs=各次進(jìn)樣的色素峰面積Fi=標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)因子Ve=進(jìn)樣體積(0.1ml)VE=萃取體積(ml)Vs=樣品體積(l)(6)這種方法僅用于葉綠素及其降解產(chǎn)物的定量.(7)檢測(cè)限隨熒光計(jì)結(jié)構(gòu)與流速而變,但對(duì)于大多數(shù)葉綠素與它們的降解產(chǎn)物來說,每次進(jìn)樣檢測(cè)限范圍在10~100pg.HPLC法的精確度主要取決于色素標(biāo)準(zhǔn)樣的純度.更理想的方法是測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣的吸收光譜(350~750nm)并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比較.色素的純度也可用HPLC法來測(cè)定,條件是不存在能與標(biāo)準(zhǔn)物的吸收和熒光譜帶相重疊的共洗脫污染物.如果分光光度法測(cè)得的數(shù)據(jù)經(jīng)脫鎂色素校正,HPLC的結(jié)果表達(dá)為色素當(dāng)量(例如:葉綠素a當(dāng)量=脫植基葉綠素a+葉綠素a+葉綠素a′,假定使用正確的分子量校正值),那么HPLC法與分光光度法提供的色素濃度與提供的EPA標(biāo)準(zhǔn)符合得很好.因此如果明顯的存在色素衍生物,用分光光度法測(cè)得的數(shù)據(jù)會(huì)偏高.要HPLC法與熒光法測(cè)得的數(shù)據(jù)一致則取決于附加的葉綠素b,c和它們的衍生物.6hplc對(duì)藻類毒素和類胡蘿卜的測(cè)定6.1檢測(cè)波長(zhǎng)及測(cè)定除色素提取物外還包括:(1)高效液相色譜泵,可進(jìn)行三種不同溶劑的梯度輸出,流速為1.0ml/m.(2)裝有200微升進(jìn)樣環(huán)管的高壓進(jìn)樣閥.(3)保護(hù)柱.(50*4.6mm,C18,5μm)(4)封尾的反相色譜柱(250*4.6mm,5μm,C18).(5)可變波長(zhǎng)或過濾吸光度檢測(cè)器,帶有低體積流通池,檢測(cè)波長(zhǎng)為436nm.(6)數(shù)據(jù)紀(jì)錄裝置.(7)注射器,玻璃,500μL(8)HPLC洗脫劑:洗脫劑A(80∶20;甲醇∶0.5M乙酸銨,pH7.2),洗脫劑B(90∶10;乙腈∶水),洗脫劑C(乙酸乙酯).(9)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物:葉綠素a和b,β,β-胡蘿卜素可購(gòu)買.其他色素標(biāo)準(zhǔn)物可用TLC或制備級(jí)HPLC從植物提取物種純化得到.在校準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)前,在專用溶劑中使用裝有單色器的分光光度計(jì)測(cè)定所有標(biāo)準(zhǔn)物的濃度.使用公式:Ci=1000(Aλmax-A750nm)/E1cmb式中Ci=各色素的濃度mg/lA=特定波長(zhǎng)下的吸光度E=吸光系數(shù)l/gcmb=比色池長(zhǎng)度cm6.2樣品前處理及檢測(cè)(1)用洗脫劑A,流速為1.0ml/m,建立和平衡HPLC系統(tǒng);(2)通過先前制備的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)的工作標(biāo)準(zhǔn).混合1ml標(biāo)準(zhǔn)物與300μL蒸餾水,搖動(dòng),平衡5分鐘后進(jìn)樣.用300μL標(biāo)準(zhǔn)液漂洗注射器2次,注射器中吸入500μL標(biāo)準(zhǔn)液用于進(jìn)樣,將注射器插入進(jìn)樣閥,充滿200μL的進(jìn)樣環(huán)管.混合1ml90%丙酮與300μL蒸餾水作為空白液.建立標(biāo)準(zhǔn)色素濃度與熒光峰面積(或高)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.(3)混合1m