河豚毒素停搏液對(duì)離體大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離ca

河豚毒素停搏液對(duì)離體大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離ca

隨著心肌缺血及重新注入機(jī)制的闡明，傳統(tǒng)的高鉀離心分離劑（miri）可導(dǎo)致心臟肌肉細(xì)胞中的na和負(fù)荷，導(dǎo)致ca2超載和心肌損傷。近年來(lái),有學(xué)者研究提出一種新的心肌保護(hù)方法-極化停搏,可提高整體缺血心臟的心肌保護(hù)。本研究主要應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù),觀察Na+通道阻滯劑河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)停搏液對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的影響,從細(xì)胞水平上探索極化心臟停搏對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。1材料和方法1.1無(wú)ca2+k-h液和sth2的水體抗氧化酶系統(tǒng)透明質(zhì)酸酶(華美生物工程公司),Fluo-3/AM(北京鼎國(guó),Sigma國(guó)內(nèi)分裝),離子載體A23187(Sigma),河豚毒素(TTX,SigmaChemicalCo.USA)。膠原酶Ⅱ、牛血清白蛋白(BSA)、胰肽酶、無(wú)水二甲亞砜、臺(tái)盼藍(lán)、EGTA、HEPEs等均由第三軍醫(yī)大學(xué)惠利試劑中心提供。無(wú)Ca2+K-H液(Krebs-Henseleitbuffer)成分(mmol/L):NaCl130,KCl4.8,MgSO41.2,NaHCO32.5,NaH2PO4-2H2O1.2,Glucose12.5,HEPEs12,pH7.4(使用前95%O2+5%CO2持續(xù)氧合)。消化酶液Ⅰ組成:膠原酶Ⅱ(0.43mg/ml),透明質(zhì)酸酶(0.3mg/ml),無(wú)Ca2+K-H液50ml。消化酶液Ⅱ組成:膠原酶Ⅱ(0.43mg/ml),透明質(zhì)酸酶(0.3mg/ml),胰肽酶(2mg/ml),BSA(0.2%),無(wú)Ca2+K-H液50ml。STH2(St.ThomasⅡ號(hào))心臟停搏液成分(mmol/L):NaCl110,KCl16,MgCl216,CaCl21.2,NaHCO310,pH7.8;TTX心臟停搏液成分:22μmol/LTTX+1mmol/LCa2+K-H液,pH7.4(使用前持續(xù)灌注95%N2+5%CO2)。1.2心肌組織病理學(xué)檢查成年Wistar大鼠6只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量250～300g,雌雄不限。經(jīng)腹腔注射肝素化,20min后頸關(guān)節(jié)脫位處死,開胸取心臟,連接并建立Langendorff灌注模型。用酶解法分離制備心室肌細(xì)胞懸液,灌流液溫度控制在37℃并持續(xù)注入95%O2+5%CO2。先用1mmol/LCa2+K-H液,以灌注壓5kPa灌注約5min。然后依次灌注無(wú)Ca2+K-H液5min,消化酶液Ⅰ循環(huán)灌注20min,消化酶液Ⅱ循環(huán)灌注10min。之后取下心臟,在7.5℃含1%BSA和0.3mmol/LCa2+K-H液的培養(yǎng)皿中取左心室并剪碎,用200μm尼龍網(wǎng)單層過(guò)濾并以上述液體洗滌3次,濾液以離心力50×g離心2min,棄上清,依次用7.5℃含0.6mmol/LCa2+K-H液、7.5℃含1.0mmol/LCa2+K-H液混勻離心2min。最后用37℃1.0mmol/LCa2+的K-H液制成單個(gè)心室肌細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性(細(xì)胞存活率95%),備用。以上液體使用前均注入95%O2+5%CO2。1.3模擬樣品階段全組共6枚成年Wistar大鼠心臟,用酶解法分離成具有搏動(dòng)性的單個(gè)心室肌細(xì)胞懸液,取100μl細(xì)胞懸液滴于載玻片上,制備多份并放入37℃的5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h取出備用。每枚心臟的心室肌細(xì)胞懸液均隨機(jī)分成基礎(chǔ)組、STH2組和TTX組?；A(chǔ)組為未停搏組,用來(lái)測(cè)定停搏前細(xì)胞[Ca2+]i。STH2組和TTX組分別為STH2停搏組和TTX停搏組。一份用來(lái)測(cè)定復(fù)搏后細(xì)胞[Ca2+]i,即分別加7.5℃STH2停搏液和TTX停搏液停搏心肌細(xì)胞,并在7.5℃下保存2h,用95%O2+5%CO2氧合的37℃1.0mmol/LCa2+K-H液進(jìn)行復(fù)搏(即建立模擬缺血/再灌注損傷的停搏/復(fù)搏細(xì)胞模型);另一份用來(lái)測(cè)定停搏期間細(xì)胞[Ca2+]i動(dòng)態(tài)變化。[Ca2+]i的測(cè)定:每個(gè)標(biāo)本分別用50μl鈣熒光指示劑Fluo-3/AM(2μmol/L)37℃避光染色30min,輕輕洗脫細(xì)胞外的鈣熒光指示劑后,置于激光掃描共聚焦顯微鏡(LeicaTCSNT,瑞士)樣品臺(tái),用488nm激光激發(fā)Fluo-3/AM指示劑鈣熒光,測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度,并減去背景熒光強(qiáng)度,通過(guò)公式[Ca2+]i=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)計(jì)算出單個(gè)細(xì)胞[Ca2+]i濃度。Fmax測(cè)定:將孵育2h的心室肌細(xì)胞懸液,用含A23187(10μmol/L)和Fluo-3/AM(2μmol/L)的10mmol/LCa2+K-H液,37℃避光孵育30min,然后用37℃10mmol/LCa2+K-H液洗脫細(xì)胞外的鈣熒光指示劑,置于LSCM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度,即為Fmax。Fmin測(cè)定:將孵育2h的心室肌細(xì)胞懸液,用含A23187(10μmol/L)、Fluo-3/AM(2μmol/L)和EGTA(10mmol/L)的無(wú)Ca2+K-H液,37℃避光孵育30min,然后用37℃無(wú)Ca2+K-H液洗脫細(xì)胞外的鈣熒光指示劑,置于LSCM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度,即為Fmin。形態(tài)學(xué)觀察:用倒置顯微鏡(OlympusIX/50,日本)觀察各組細(xì)胞搏動(dòng)情況和形態(tài)學(xué)變化?；钚募〖?xì)胞標(biāo)準(zhǔn):胞體透明,桿狀,無(wú)皺褶,邊界清晰,部分可見搏動(dòng)。1.4統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1不同停博弈前后基礎(chǔ)組差異顯著性分析TTX組和STH2組心肌細(xì)胞復(fù)搏后[Ca2+]i(nmol/L)分別為(148.36±19.05)和(213.65±26.6),均明顯高于停搏前基礎(chǔ)組(83.06±8.28),且差異具有顯著性(P<0.01);TTX組明顯低于STH2組,且差異具有顯著性(P<0.01,圖1)。2.2各組心肌細(xì)胞“ca2+2+1a的下降速度和幅度比較STH2組和TTX組在加入7.5℃STH2停搏液或TTX停搏液后,[Ca2+]i均立即下降,TTX組下降速度和幅度明顯高于STH2組,其后均上升,STH2組上升速度和幅度明顯高于TTX組,至約60min時(shí),TTX組心肌細(xì)胞[Ca2+]i超過(guò)原有基礎(chǔ)水平約5nmol/L,而STH2組已超過(guò)原有基礎(chǔ)水平約25nmol/L,然后均緩慢上升(圖2)。2.3各組復(fù)博弈頻率的比較TTX組和STH2組心肌細(xì)胞復(fù)搏后搏動(dòng)頻率(min-1)分別為(17.18±9.15)和(12.36±6.05),均明顯低于基礎(chǔ)組(48.18±17.30)(P<0.01);而TTX組和STH2組搏動(dòng)頻率無(wú)明顯差別(P>0.05);TTX組和STH2組復(fù)搏后中具有活力的正常形態(tài)心肌細(xì)胞所占比例(%)分別為(36±2.71)和(20±1.72),均明顯低于基礎(chǔ)組(94±1.47),且差異具有顯著性(P<0.01);TTX組明顯高于STH2組,且差異具有顯著性(P<0.01)。3河開展了河蚊毒素停博弈液對(duì)離體大鼠心肌細(xì)胞的停采血和復(fù)采血心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中起著重要作用。生理狀況下其觸發(fā)心肌細(xì)胞收縮、參與細(xì)胞電活動(dòng)以及作為第二信使參與酶活性和細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)。病理情況下細(xì)胞內(nèi)鈣超載可抑制細(xì)胞的舒縮功能,激活細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴酶的活性,促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化,造成細(xì)胞不可逆性損傷。Ca2+超載是MIRI病理鏈中關(guān)鍵環(huán)節(jié),是細(xì)胞損害的必經(jīng)途徑。心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的變化是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣池?cái)z取、釋放Ca2+等過(guò)程動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果,胞外Ca2+內(nèi)流和胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)動(dòng)員形成的鈣震蕩在各種生理過(guò)程中起著重要作用,Ca2+內(nèi)流和Ca2+分隔機(jī)制失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,造成心肌細(xì)胞損害。防止或減輕缺血/再灌注后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,必將改善心臟的舒縮功能,提高心肌保護(hù)效果。Na+通道阻滯劑TTX極化心臟停搏,即誘導(dǎo)心臟停搏在極化狀態(tài),維持心肌細(xì)胞膜電位(Em)接近于靜息Em。文獻(xiàn)報(bào)道,河豚毒素(TTX)是一種具有強(qiáng)有力的和快速可逆的Na+通道阻滯劑,能選擇性地阻滯心肌缺血期間內(nèi)向性Na+電流,從而防止缺血早期Na+超載,繼而減輕Ca2+超載,改善缺血再灌注后的心臟功能恢復(fù)。已有研究證實(shí),與高K+去極化心臟停搏液比較,TTX極化心臟停搏液可明顯促進(jìn)離體大鼠心臟的血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)恢復(fù)、保存高能磷酸鹽含量和減輕超微結(jié)構(gòu)損傷。本實(shí)驗(yàn)研究Na+通道阻滯劑河豚毒素停搏液對(duì)離體大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i影響,從細(xì)胞水平上探討極化心臟停搏液對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。采用酶解法將成年大鼠心臟分離成具有搏動(dòng)性的單個(gè)心室肌細(xì)胞懸液,保存了良好的細(xì)胞活性(細(xì)胞存活率95%),并建立模擬缺血/再灌注損傷的停搏/復(fù)搏細(xì)胞模型,用新一代鈣熒光指示劑Fluo-3/AM標(biāo)記后,以激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù),精確地實(shí)時(shí)測(cè)定單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度。該實(shí)驗(yàn)方法的創(chuàng)新之處是,在分離具有搏動(dòng)性的單個(gè)心室肌細(xì)胞懸液基礎(chǔ)上,成功建立了模擬心肌缺血/再灌注損傷的停搏/復(fù)搏心肌細(xì)胞模型。結(jié)果表明:①模擬缺血/再灌注損傷的心肌細(xì)胞停搏/復(fù)搏后,TTX組心肌細(xì)胞[Ca2+]i明顯低于STH2組(P<0.01),說(shuō)明TTX極化心臟停搏液與STH2去極化心臟停搏液比較,能明顯減輕停搏/復(fù)搏后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。②停搏期間心肌細(xì)胞[Ca2+]i測(cè)定結(jié)果顯示,TTX組中心肌細(xì)胞[Ca2+]i上升幅度和速度明顯低于STH2組,說(shuō)明TTX極化心臟停搏液與STH2去極化心臟停搏液比較,能明顯減輕停搏期間心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。③模擬缺血/再灌注損傷的心肌細(xì)胞停搏/復(fù)搏后,心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率TTX組高于STH2組,但無(wú)顯著差異(P>0.05),提示復(fù)搏后兩組細(xì)胞活動(dòng)能力無(wú)明顯差別;但從形態(tài)學(xué)比較,具有活力的正常形態(tài)心肌細(xì)胞比例TTX組明顯高于STH2組(P<0.01)。這說(shuō)明TTX極化心臟停搏液較STH2去極化心臟停搏液能較好地保護(hù)心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果提示:河豚毒素停搏液與高鉀去極化心臟停搏液相比較,能顯著減輕心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和提高心肌細(xì)胞保護(hù)效果,