肝細(xì)胞肝癌中的血管生成擬態(tài)

肝細(xì)胞肝癌中的血管生成擬態(tài)

血管生成異常（mv）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種血液供應(yīng)方式。腫瘤組織通過(guò)血管生成可與宿主血管相連通從而獲得足夠的血液供應(yīng)而呈進(jìn)行性生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)的特點(diǎn)是:腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管形成圍成管道樣結(jié)構(gòu),管道內(nèi)沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆,血液在這種無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞的管道中流動(dòng)。血管生成擬態(tài)完全不同于人們所熟悉的內(nèi)皮依賴性血管,它的存在對(duì)以往只是針對(duì)內(nèi)皮依賴性血管進(jìn)行抗血管形成治療從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的研究提出了挑戰(zhàn)。到目前為止,人們對(duì)于血管生成擬態(tài)的研究局限于高度惡性的雙向分化腫瘤,對(duì)上皮來(lái)源的惡性腫瘤很少涉及。肝癌最多見(jiàn)為肝細(xì)胞性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌),手術(shù)切除雖是療效最好的方法,但肝癌根治性切除后5年復(fù)發(fā)率仍較高,肝癌總體預(yù)后差主要與肝癌富有血管并有較強(qiáng)的侵襲性有關(guān)。本研究通過(guò)構(gòu)建肝癌細(xì)胞HepG2的三維培養(yǎng)模型以及在人肝癌石蠟標(biāo)本中利用免疫組織化學(xué)和組織化學(xué)雙重染色技術(shù)觀察肝癌中是否存在血管生成擬態(tài)。1材料和方法1.1細(xì)胞庫(kù)和fbs肝癌細(xì)胞株為HepG2,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);10%FBS為杭州四季青產(chǎn)品;倒置顯微鏡(CK40)為日本Olympus公司產(chǎn)品。1.2細(xì)胞培養(yǎng)液/培養(yǎng)基三維細(xì)胞培養(yǎng)模型構(gòu)建:自制鼠尾膠原,取直徑35mm玻璃培養(yǎng)皿一個(gè)(消毒前放入一張18mm×18mm蓋玻片),加入25!l鼠尾膠原,室溫下4~5min待膠原凝固后,加入3!l含有1×106個(gè)HepG2細(xì)胞的完全培養(yǎng)液(RPMI-1640+10%FBS),再加入2ml的完全培養(yǎng)液,放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日更換培養(yǎng)液,共培養(yǎng)7天。1.3edwdson分級(jí)收集2001~2006年間蘭州大學(xué)病理研究所15例肝穿刺活檢及手術(shù)切除的肝癌石蠟包埋標(biāo)本。男性9例,女性6例;年齡35~70歲;Edmondson病理分級(jí)Ⅰ級(jí)2例,Ⅱ級(jí)4例,Ⅲ級(jí)7例,Ⅳ級(jí)2例。小鼠抗人CD31單克隆抗體(即用型,進(jìn)口分裝),兔抗人Ferritin多克隆抗體(即用型,進(jìn)口分裝),均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司;免疫組化即用型二步法試劑盒,DAB顯色試劑盒,為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品。1.4schiff染色免疫組化采用二步法:切片常規(guī)脫蠟水化;3%H2O2去離子水孵育10min;對(duì)進(jìn)行CD31免疫組織化學(xué)染色的切片進(jìn)行抗原修復(fù);加入一抗4℃過(guò)夜;滴加試劑1,37℃孵育20min;滴加試劑2,37℃孵育30min;DAB顯色。PAS復(fù)染:顯微鏡下觀察,待CD31陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞著色后,水流沖洗1min終止顯色反應(yīng);將切片置于0.5%的過(guò)碘酸溶液中氧化15min;蒸餾水洗3min×2次后置于Schiff液中,避光環(huán)境下PAS反應(yīng)15min;蒸餾水洗3次,每次1min,流水沖洗3min;蘇木精淺染細(xì)胞核5min,流水沖洗2min;分化,返藍(lán),常規(guī)脫水,透明,樹膠封固。2結(jié)果2.1肺癌細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)HepG2細(xì)胞接種后6h,細(xì)胞均貼附在膠原面上,肝癌細(xì)胞為多邊形,彼此之間呈鑲嵌樣生長(zhǎng),胞漿豐富,核圓形,居中,可見(jiàn)核仁,個(gè)別細(xì)胞可見(jiàn)雙核。48h以后,部分肝癌細(xì)胞伸出細(xì)長(zhǎng)突起,彼此之間相互連接,形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)第7天時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,明顯可見(jiàn)肝癌細(xì)胞彼此連接形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。用4%甲醛固定后進(jìn)行PAS染色,可見(jiàn)大量的網(wǎng)絡(luò)樣,環(huán)狀PAS陽(yáng)性圖案形成。見(jiàn)圖1。2.2免疫組織化學(xué)和組織化學(xué)雙重染色結(jié)果2.2.1pas雙重染色15例肝癌免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)血管內(nèi)皮CD31染色均為陽(yáng)性,肝癌細(xì)胞Ferritin染色均為陽(yáng)性。其中7例標(biāo)本的CD31與PAS雙重染色可見(jiàn)由CD31陰性的腫瘤細(xì)胞圍成管道樣結(jié)構(gòu),管腔中可見(jiàn)紅細(xì)胞,一層PAS陽(yáng)性物質(zhì)圍成基底膜樣結(jié)構(gòu)將腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞分開。Ferritin與PAS雙重染色亦可見(jiàn)Ferritin染色陽(yáng)性,大而呈多邊形,胞漿充滿顆粒,核仁大,排列成不規(guī)則小梁狀的肝癌細(xì)胞圍成管道樣結(jié)構(gòu),一層PAS陽(yáng)性物質(zhì)將腫瘤細(xì)胞同管腔分隔,腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的管腔結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)紅細(xì)胞存在。見(jiàn)圖2。2.2.2肝腫瘤的程度與血管生成的適應(yīng)關(guān)系3血管生成擬態(tài)的發(fā)現(xiàn)與診斷腫瘤的生長(zhǎng)分為兩個(gè)明顯的階段:無(wú)血管期(avascularstage)和血管期(vascularstage)。在無(wú)血管期,腫瘤生長(zhǎng)主要靠周圍組織的彌散作用提供營(yíng)養(yǎng),腫瘤生長(zhǎng)緩慢,體積不超過(guò)2~3mm3;在血管期,毛細(xì)血管的生成使腫瘤能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng),腫瘤迅速生長(zhǎng)并可以發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是多階段的級(jí)聯(lián)過(guò)程(cascadeprocess)。其主要步驟包括:原發(fā)癌生長(zhǎng);腫瘤血管生成;腫瘤細(xì)胞脫落并侵入基質(zhì);進(jìn)入脈管系統(tǒng);癌栓形成;繼發(fā)癌生長(zhǎng);腫瘤血管生成;轉(zhuǎn)移癌的繼續(xù)擴(kuò)散。從上述過(guò)程可以看出,腫瘤的血管生成對(duì)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和增殖是必不可少的,同時(shí)對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移亦起著重要作用。1966年Warren等在研究移植于倉(cāng)鼠夾囊中的人黑色素瘤血管形成模式和超微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種缺乏內(nèi)皮細(xì)胞的血液通道,但并未進(jìn)一步研究,直到1999年Maniotis等在研究人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了這種血液通道的存在,并將其命名為血管生成擬態(tài)。到目前為止,炎性乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、骨肉瘤、以及一些雙向分化腫瘤:黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤,間皮肉瘤組織中也被證實(shí)存在血管生成擬態(tài)。在血管生成擬態(tài)發(fā)現(xiàn)之前,人們認(rèn)為腫瘤中生成的血管都是內(nèi)皮依賴性血管,對(duì)抗腫瘤藥物的研究主要是抑制內(nèi)皮依賴性血管的生成,試圖通過(guò)這種途徑對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。近年來(lái)對(duì)血管生成擬態(tài)的研究多數(shù)局限于高度惡性的雙向分化腫瘤,肝癌是一種血供豐富,惡性程度高,預(yù)后很差的上皮來(lái)源惡性腫瘤。本文采用了三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),在傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)體系中,細(xì)胞離開了在體內(nèi)與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的整體環(huán)境,它們所表現(xiàn)出的生物學(xué)行為也必然與體內(nèi)有很大差異。本實(shí)驗(yàn)采用的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),是將細(xì)胞放在膠原凝膠中生長(zhǎng),使它們?cè)隗w外也能與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用,表達(dá)其生物學(xué)特征。三維培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)肝癌細(xì)胞可借助膠原支架生長(zhǎng),細(xì)胞伸出細(xì)長(zhǎng)突起,彼此之間相互連接,形成環(huán)狀網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),說(shuō)明肝癌細(xì)胞具有自身變形能力,模仿內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣通道以適應(yīng)腫瘤內(nèi)缺血缺氧的環(huán)境,為腫瘤的生長(zhǎng)提供更為豐富的血供。肝癌組織中存在大量的肝血竇,在HE染色切片中肝血竇與血管生成擬態(tài)很難區(qū)分,本研究采用肝細(xì)胞的特異性標(biāo)記物Ferritin對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,從而能夠觀察到圍成血管生成擬態(tài)的細(xì)胞是否為肝癌細(xì)胞。為了進(jìn)一步證明肝癌中血管生成擬態(tài)的存在,對(duì)同一個(gè)石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片,兩張連續(xù)切片分別進(jìn)行CD31與PAS、Ferritin與PAS的免疫組化與組織化學(xué)雙重染色。CD31與PAS雙重染色顯示血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)中沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),腫瘤細(xì)胞貼附在PAS陽(yáng)性的基底膜樣結(jié)構(gòu)外面,血管生成擬態(tài)管腔中有紅細(xì)胞存在,而管腔中紅細(xì)胞的存在證實(shí)了血管生成擬態(tài)是一種功能性血管。Ferritin免疫組化與PAS雙重染色證實(shí)圍成血管生成擬態(tài)的細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。另外,本實(shí)驗(yàn)還觀察到分化好的肝癌中血管生成擬態(tài)的形成少于分化差的肝癌;隨著分化程度的降低肝癌細(xì)胞逐漸出現(xiàn)CD31著色陽(yáng)性傾向,說(shuō)明肝癌細(xì)胞可能有表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表型,模擬內(nèi)皮細(xì)胞功能的傾向。本研究由于病例數(shù)量較少,沒(méi)有對(duì)其做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血管生成擬態(tài)的研究尚屬初步階段,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)部分高度惡性腫瘤中是否存在血管生成擬態(tài)進(jìn)行了初步的探索。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞三維培養(yǎng)及免疫組織化學(xué)的研究證實(shí)了肝癌組織中確實(shí)存在這種特殊的血液供應(yīng)方式,并初步發(fā)現(xiàn)肝癌中血管生成擬態(tài)的形成與其分化程度有一定的關(guān)系。肝癌因?yàn)槠鋹盒猿潭雀?預(yù)后差,術(shù)后復(fù)發(fā)率高,對(duì)它的治療一直沒(méi)有較好的方法,對(duì)血管生成擬態(tài)的分子機(jī)制的研究將可能為肝