新型酶制劑匯總

新型酶制劑――β-甘露聚糖酶研究進展

植物細胞壁重要由纖維素、半纖維素及木質素等物質構成。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β-1,4-D-甘露糖連接而成的線狀多聚體，在多糖的側鏈上重要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基團，圖1為甘露聚糖的分子構造示意圖。甘露聚糖含有高親水性，在單胃動物的消化道內大量吸水，增加了消化道內容物的粘度，抵抗胃腸的蠕動，直接影響動物對營養(yǎng)物質的消化和吸取。近年來，隨著豆類產品（豆粕等）在動物飼料中的廣泛應用，甘露聚糖的抗營養(yǎng)作用也越來越受到重視，在飼料中添加酶制劑是解決這一問題的重要途徑。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和脫乙酰酶(EC3.1.1.6)的協(xié)同作用，其中β-甘露聚糖酶在飼料中的應用比較廣泛。1.β-甘露聚糖酶的來源和酶學性質研究β-甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中，在某些低等動物（如海洋軟體動物Littorinabrevicula）的腸道分泌液中、某些豆類植物（如長角豆、瓜兒豆等）發(fā)芽的種子中以及天南星科植物魔芋萌發(fā)的球莖中都發(fā)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶酶活的存在。而微生物（涉及真菌、細菌和放線菌等）則是飼用β-甘露聚糖酶的重要來源，多個微生物產生β-甘露聚糖酶的條件和所產酶活性的高低、酶的性質和作用方式以及蛋白質一級構造等都有所不同。微生物來源的β-甘露聚糖酶含有活性高、成本低、提取方便以及比動植物來源的有更廣的作用pH值、溫度范疇和底物專一性等明顯特點，備受研究者的重視，其中，細菌中的芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、青霉、酵母、木霉和放線菌中的鏈霉菌等產的β-甘露聚糖酶等研究的較多，表1中列出了部分微生物產的β-甘露聚糖酶及其酶學特性?，F(xiàn)在，已有許多不同來源的β-甘露聚糖酶獲得了純化，如田新玉（1993）首先報道了嗜堿性芽孢桿菌Bacillussp.N16-5產生的3種胞外堿性β-甘露聚糖酶。楊文博（1995）、余紅英（）、吳襟（）分別對地衣芽孢桿菌BacilluslichienoformisNK-27產生的堿性β-甘露聚糖酶、枯草芽孢桿菌SA-22產生的中性β-甘露聚糖酶、諾卡氏菌形放線菌NocardioformactinomycetesNA3-540C產生堿性β-甘露聚糖酶的純化及性質作了報道。在真菌方面，田亞平（1998）、王和平（）分別就黑曲霉WX-96所產的β-甘露聚糖酶、里氏木酶RutC-30所產的酸性β-甘露聚糖酶進行了酶純化和性質研究。國外Ademark（1998）和Yosida（1997）分別報道了黑曲霉、環(huán)狀芽孢桿菌β-甘露聚糖酶的純化和性質。不同微生物所產的β-甘露聚糖酶的分子質量、最適反映pH、等電點、最適反映溫度、酶動力學常數(shù)、底物專一性等都有一定的差別。β-甘露聚糖酶的分子質量小的只有22kDa，大的能夠達成162kDa，相差十分懸殊，但大部分在30kDa～55kDa。表1.部分微生物產生的β-甘露聚糖酶及其性質菌株分子量最適溫度最適pH參考文獻Bacilluslicheniformis__506.0ZhangetalTrichodermaharzianum32.5553.0FerreiraandFilhoBacillussubtilis3950-557.0ZakariaetalBacillusstearothermophilus73705.5-7.5TalbotandSyguschAspergillusfumigatus60604.5Puchartetal63604.5Aspergillusniger40__3.5AdemarketalSclerotiumrolfsii61.2702.9GubizetalTrichodermareesei46755.0Arisan-Atacetal圖1枯草芽孢桿菌圖2假單胞菌真菌來源的β-甘露聚糖酶的作用范疇偏酸，普通在pH4.0～5.5之間，最適反映溫度普通在55℃～75℃。如1990年JohnsonKG研究的里氏木霉的甘露聚糖酶，最適pH為5.5，最適反映溫度為65℃；李江華等研究的黑曲霉的甘露聚糖酶，最適pH為5.5，最適反映溫度為35℃。細菌和放線菌來源的甘露聚糖酶最適作用pH卻常為中性或者偏堿性，最適反映溫度為45℃～70℃。細菌中，研究最多的是芽孢桿菌，除嗜堿芽孢桿菌高至pH9.0以上之外，最適反映pH多為5.5～7.0。馬建華等研究的枯草芽孢桿菌最佳反映pH為6.4，最適反映溫度為50℃。總之，真菌來源的β-甘露聚糖酶作用偏酸性，而細菌和放線菌產β-甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏堿性，且穩(wěn)定性較好。單胃動物飼料中使用的β-甘露聚糖酶規(guī)定是酸性的，國內外對來源于不同菌種的β-甘露聚糖酶的生產有所報道，但多集中在堿性和中性β-甘露聚糖酶方面，而有關酸性β-甘露聚糖酶的微生物發(fā)酵生產國內極少有報道，因此，對酸性β-甘露聚糖酶的研究及進行工業(yè)化推廣將在飼料工業(yè)中含有較大的應用潛力。運用分子生物學手段，能夠開發(fā)生產酶活性高、適應性強的微生物菌種。β-甘露聚糖酶分子生物學的研究進展較快，到現(xiàn)在為止有Rhodothermusmarinus（Politz等，）、DictyoglomusthermophilumRt46B1（Gibbs等，1999）、Aspergillusaculeatus（Christgau等，1994）、Bacillusstearothermophilus（Ethier等，1998）、西紅柿種子（Bewley等，1997）等多個微生物和動植物的β-甘露聚糖酶基因先后被克隆和體現(xiàn)，這些為開發(fā)新的、能滿足飼料工業(yè)需要的產酶菌提供了條件。2.β-甘露聚糖酶的作用方式及其水解產物β-甘露聚糖酶是水解1，4-β-D-吡喃甘露糖為主鏈的內切水解酶，作用底物重要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖。不同來源的β-甘露聚糖酶對不同來源的底物作用深度及其水解產物是不相似的。β-甘露聚糖酶水解底物的方式和深度重要與α-半乳糖殘基和葡萄糖殘基在主鏈中的位置、含量、酯?；某潭扔嘘P。底物本身的物理狀態(tài)也會影響酶對底物的作用，如結晶狀態(tài)的甘露聚糖不易被降解。甘露聚糖經β-甘露聚糖酶作用后，通過HPLC或紙層析辦法分析，重要產物是寡聚糖（普通2～10個殘基），產物聚合度的大小與酶和底物的來源有關（McCleary，1988；田新玉等，1993；楊文博等，1995；Arison-Atac等，1993），但相對來說產生單糖（甘露糖）極少或根本不產生。寡聚糖是一種新型的功效性低聚糖；能明顯地增進人體和動物腸道內有益菌——雙歧桿菌的增殖，改善腸道內菌群構造是一種較好的雙歧因子。3.β-甘露聚糖酶的分子生物學研究有關酶的分子特性和催化機制方面的研究報道還極少。吳襟等運用化學修飾的辦法對諾卡氏菌形放線菌產的甘露聚糖酶的構造與功效進行了初步研究，證明了酶蛋白的巰基、酪氨酸殘基及色氨酸殘基是維持酶活性必需的基團。進一步研究證明蛋白內部的二硫鍵是影響該酶熱穩(wěn)定性的重要因素。Cann等從Thermoanaerobacteriumpolysaccharolyticum中克隆到一種高分子量（119.6kDa）甘露聚糖酶，缺失突變證明了該酶含有兩個纖維素結合區(qū)和一種催化功效區(qū)。4.β-甘露聚糖酶的應用研究4.1β-甘露聚糖酶在飼料中的應用研究豆類、谷類及其副產品中普遍存在著一種抗營養(yǎng)因子——β-D-甘露聚糖，因不能被單胃動物消化，減少了飼料的運用率。β-甘露聚糖酶含有能分解β-D-甘露聚糖，減少消化道內容物黏度；破壞細胞壁的構造，使營養(yǎng)物質能與消化酶充足接觸；提高動物內源酶(如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等)的活性；改善腸道微生物菌群和提高腸黏膜的完整性等功效。加入β-甘露聚糖酶能分解β-甘露聚糖，使之轉化為甘露低聚糖，從而減少β-甘露聚糖的抗營養(yǎng)作用，提高飼料的運用率，增進畜禽生長，減輕環(huán)境的污染。另外，β-甘露聚糖酶分解β-D-甘露聚糖生成的甘露低聚糖，能吸附病原菌、增進腸道有益菌群的增殖，提高動物的生產性能。長久使用可避免沙門氏菌、肉毒桿菌等致病菌的感染、在腸道的繁殖和定植，減少抗生素的添加量。β-甘露聚糖酶能降解飼料中的甘露聚糖，不僅消除了甘露聚糖的抗營養(yǎng)作用，同時生成的甘露寡糖在動物生產中起著重要的作用。Dvorak的實驗證明，甘露寡糖能提高仔豬日增重和飼料轉化率，其因素可能是其提高了仔豬的免疫力，克制了病原菌在胃腸道的增值。甘露寡糖含有一定的免疫原性，能夠刺激機體免疫應答，并且與病毒、毒素結合，減緩抗原的吸取，能夠調節(jié)腸道的菌群，干擾病原菌的定植。近年來有關甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越來越受到人們的重視。Trenholm研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖可結合玉米赤霉烯酮，通過物理吸附或直接結合霉菌毒素，且不影響其它飼料成分。研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能夠明顯提高無菌仔豬血清和腸粘膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白細胞介素-2的水平，增強T淋巴細胞功效和小腸原始淋巴細胞的活性，增強小腸內白細胞的吞噬能力和增進淋巴細胞釋放IFN-γ細胞素。邵良平等報道，甘露寡糖能極明顯提高仔豬白細胞分化抗體CD3的水平。胃腸道非免疫防御系統(tǒng)重要構成成分為內源微生物群，而內源微生物群又常分為有益微生物群（如雙歧桿菌屬、真桿菌屬、乳酸桿菌屬）和有害微生物群（如大腸桿菌屬。產氣夾膜梭菌屬、葡萄球菌屬）。研究表明，甘露寡糖能調控動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境，增進有益菌的生長和繁殖，克制有害菌對腸道的粘附和定植。維持正常的消化道環(huán)境。Sisak在日糧中添加0.1%的甘露寡糖，仔雞盲腸、胴體沙門氏菌的檢出率分別減少58%和56%。Spring報道，甘露寡糖能加強豬對沙門氏菌、溶血性大腸桿菌和彎桿菌等感染的免疫應答?，F(xiàn)在，國內外規(guī)?；a甘露聚糖酶的公司有美國的ChemGen、丹麥novozyme、北京博仕奧生物技術有限公司等。β-甘露聚糖酶在單胃動物體內的作用位點決定了飼料中使用的β-甘露聚糖酶規(guī)定是酸性的（如表2）。表2β-甘露聚糖酶在動物體內的作用位點pH值嗉囊肌胃（胃）小腸禽4.672.945.8~6.20豬

3.06.0~6.4Jackson等研究表明，β-甘露聚糖酶能提高玉米-豆粕型日糧雞的飼料轉化率，并增進肉雞及火雞的日增重和飼料運用率，提高蛋雞的生產性能。在產蛋早期的前12周，在飼料中添加β-甘露聚糖酶，雞蛋的平均重量可增加約0.3g／只；產蛋期的第12周到第24周，可使蛋雞的日產蛋量提高0.7％～1.07％；24周后來添加，日產蛋量可增加約1.5％。研究也表明，β-甘露聚糖酶能增加產蛋早期雞蛋的重量，可延遲高峰后期的產蛋率的下降。肉雞的研究數(shù)據(jù)顯示，β-甘露聚糖酶可提高肉雞的日增重和飼料運用率。王春林等報道，低能量飼料添加β-甘露聚糖酶能夠提高飼料的轉化率。并且，日糧中添加β-甘露聚糖酶可通過內分泌和免疫調節(jié)途徑提高雞的抗病力，改善肉雞的健康狀況。李國勝等報道，實驗組(基礎日糧中添加0.05%β-甘露聚糖酶)體質量變系數(shù)為10%，對照組（基礎日糧）體質量的變異系數(shù)為14%。在飼料中添加β-甘露聚糖酶，可明顯提高豬的采食量、飼料運用率、日增重；日糧粗纖維含量相似時，在飼料中添加β-甘露聚糖酶可減少豬糞的排泄量。Pettey等研究表明，在仔豬階段，日糧添加β-甘露聚糖酶，能明顯提高仔豬的采食量，增進飼料運用率，提高仔豬的生長速度和日增重，使豬的生長性能得到很大的提高。飼料中添加β-甘露聚糖酶能明顯提高豬對于粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、無氮浸出物的消化能力，也可提高飼料的消化能。在豬的整個喂養(yǎng)階段日糧添加β-甘露聚糖酶，日飼料消耗量、料肉比、喂養(yǎng)周期都得到明顯的減少，平均日增重有了很大的提高。黃小文等報道，大豬日糧中分別添加1000U/g和U/g甘露聚糖酶比對照組平均日增重分別提高6.22%和12.99%。4.2在食品行業(yè)中的應用β-甘露聚糖酶能夠水解甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳糖甘露聚糖和半乳糖葡甘露聚糖生成甘露低聚糖。甘露低聚糖作為雙歧桿菌的增殖因子，可有效地使體內有益菌自然增殖、改善腸道菌群構造、調節(jié)腸道消化系統(tǒng)功效，因此甘露低聚糖含有保肝、抗腫瘤、增強免疫力、加強腸道蠕動、減少膽固醇、抗衰老等生理活性，合用于多個腸道疾病，同時也適合于健康人特別是老年人和小朋友的日常保健，再加上甘露低聚糖含有優(yōu)良的甜味品質，可替代蔗糖，用于飲料、糖果、餅干、果脯和乳制品等食品中，是一種良好的食品添加劑，國外已廣泛應用于保健品中。因此在食品中添加一定量的β-甘露聚糖酶，可減少營養(yǎng)物質在腸道內的蓄積，改善營養(yǎng)物質的消化吸取。魔芋膠為葡萄甘露聚糖，經β-甘露聚糖酶作用后形成一系列的低聚糖。實驗證明，魔芋膠的酶解物能有效地改善腸道內菌群構造，且其性能及效果優(yōu)于大豆低聚糖及半乳糖基轉移低聚糖。同時魔芋低聚糖對防治高血脂癥、防止動脈硬化和冠心病的發(fā)生有一定作用。近年來發(fā)現(xiàn)，低聚糖對動物健康和生產機能的增進作用就某些方面來說，并不亞于抗生素，且為綠色食品，因而低聚糖不管作為功效性食品或是作為動物飼料添加劑均含有廣闊的市場前景。我國