微生物蛋白質(zhì)組學(xué)

微生物蛋白質(zhì)組學(xué)1精選課件◆蛋白質(zhì)組學(xué)◆豬瘟病毒感染蛋白質(zhì)組學(xué)研究◆病毒感染蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展2精選課件第一局部蛋白質(zhì)組學(xué)—Wilkins于1994年提出蛋白質(zhì)組概念?！鞍踪|(zhì)組比較公認(rèn)的定義，基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)目等于基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)目？在一個(gè)細(xì)胞中，并不是所有基因都是同時(shí)表達(dá)的，因此，一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)數(shù)目少于基因組中基因的數(shù)目。另一方面，從基因可變剪切和蛋白質(zhì)修飾的角度看，蛋白質(zhì)數(shù)目又遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于基因組中基因的數(shù)目。蛋白質(zhì)組的概念3精選課件蛋白質(zhì)組學(xué)的概念—蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)，旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及其功能模式，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、存在方式〔修飾方式〕、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。蛋白質(zhì)組學(xué)與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究不同之處：蛋白質(zhì)組學(xué)研究是在生物體或細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行的，從一個(gè)機(jī)體或細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體活動(dòng)的角度來揭示和說明生命活動(dòng)的根本規(guī)律蛋白質(zhì)組研究的意義蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接表達(dá)者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接說明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。蛋白質(zhì)本身的存在方式和活動(dòng)規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間的相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問題仍需要直接對(duì)蛋白質(zhì)的研究來解決。4精選課件蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)與難點(diǎn)——蛋白質(zhì)組與基因組的區(qū)別與聯(lián)系■同一性與多樣性—基因組作為遺傳信息的載體，其最主要的特征就是同一性。對(duì)單細(xì)胞生物而言，不管在什么條件下，其基因組始終是不變的。對(duì)多細(xì)胞生物而言，同一個(gè)個(gè)體的基因組不管是在不同的發(fā)育階段或不同種類的細(xì)胞是同樣的?！鞍踪|(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者和表達(dá)者，對(duì)于不同類型的細(xì)胞或同一細(xì)胞在不同的活動(dòng)狀態(tài)下，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成是不一樣的。5精選課件■有限與無限—對(duì)基因組而言，不同物種的基因組，不管其大小，其核甘酸的數(shù)量是一定的、明確的?！獙?duì)蛋白質(zhì)組而言，一個(gè)細(xì)胞或生命體蛋白質(zhì)的種類究竟是多少那么很難確定?！窦?xì)胞內(nèi)的大局部蛋白質(zhì)通常被進(jìn)行過翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化、?；?。修飾過的蛋白質(zhì)具有其特定的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能。對(duì)蛋白質(zhì)修飾的研究構(gòu)成了蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)分支：修飾蛋白質(zhì)組學(xué)?！袢绻f表達(dá)的蛋白質(zhì)的種類可以根據(jù)基因的數(shù)目來確定，那么修飾形成的蛋白質(zhì)種類只有依靠對(duì)蛋白質(zhì)的直接研究來決定，而這種研究是沒有止境的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的修飾與生命的活動(dòng)密切相關(guān)。從這種意義上來講，對(duì)基因組核甘酸序列的測(cè)定是一種“有限〞的工作，而對(duì)蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)種類確實(shí)定那么是一種“無限〞的工作。蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的區(qū)別與聯(lián)系6精選課件■靜態(tài)與動(dòng)態(tài)—一個(gè)個(gè)體的基因組自個(gè)體誕生到死亡，始終保持不變。而作為新陳代謝的主要執(zhí)行者的蛋白質(zhì)組，在個(gè)體的生命活動(dòng)中卻總是變動(dòng)不停。人們可以通過確定變化的蛋白質(zhì)來理解其功能。因此，蛋白質(zhì)研究的一個(gè)重要任務(wù)是，找出蛋白質(zhì)組里發(fā)生了變化的蛋白質(zhì)?！顒?dòng)中的蛋白質(zhì)可大致分為兩類：一類是比較穩(wěn)定的，如負(fù)責(zé)細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)。一類是隨細(xì)胞的活動(dòng)和狀態(tài)發(fā)生量或質(zhì)變化的蛋白質(zhì)，如負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞活動(dòng)調(diào)控的蛋白質(zhì)。在這種意義上，人們把以研究蛋白質(zhì)變化為主的蛋白質(zhì)組學(xué)稱為功能蛋白質(zhì)組學(xué)。其主要是比較在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下或病理狀態(tài)下的同一種細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)組內(nèi)的差異蛋白質(zhì)。與此相對(duì)應(yīng)，測(cè)定一個(gè)細(xì)胞或組織含有的全部蛋白質(zhì)種類的研究就是通常所說的蛋白質(zhì)組學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的區(qū)別與聯(lián)系7精選課件■時(shí)間與空間—DNA通常位于細(xì)胞核內(nèi)，且保持穩(wěn)定，因此測(cè)定基因組的DNA序列不受時(shí)空影響。對(duì)于轉(zhuǎn)錄的mRNA來說，時(shí)間是主要的參考因素，在發(fā)育的不同階段或細(xì)胞的不同活動(dòng)時(shí)期，mRNA的表達(dá)是不一樣的。因此，在研究轉(zhuǎn)錄組或基因芯片時(shí)必須考慮到時(shí)間，但通常不需考慮空間的影響?！诘鞍踪|(zhì)組的研究中，不僅要考慮時(shí)間的因素，更要考慮空間的影響。

首先，不同的蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞的不同部位，其功能與其空間定位密切相關(guān)。

其次，許多蛋白質(zhì)在細(xì)胞里不是靜止不動(dòng)的，它們?cè)诩?xì)胞里常常通過在不同的亞細(xì)胞環(huán)境里的運(yùn)動(dòng)發(fā)揮作用。如細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控也常常依賴于蛋白質(zhì)在空間位置的變化和運(yùn)動(dòng)。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)中又派生了一個(gè)與空間緊密相關(guān)的新研究領(lǐng)域：亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)。這種亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組可能是細(xì)胞器蛋白質(zhì)組，如高爾基體蛋白質(zhì)組，也可能比細(xì)胞器還要小的組分，如核膜。8精選課件■孤立行為與相互作用—基因組的基因表達(dá)的各種mRNA是彼此孤立的，互不干擾。—蛋白質(zhì)彼此間有著廣泛的相互作用，不存在不與其他蛋白質(zhì)發(fā)生作用的“孤立蛋白質(zhì)〞。蛋白質(zhì)的功能實(shí)現(xiàn)離不開蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與其他生物大分子之間的相互作用。●蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)主要內(nèi)容是研究大規(guī)模的蛋白質(zhì)的相互作用：相互作用組。●相互作用組研究可分為兩類：研究蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)：酵母雙雜交、噬菌體顯示和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究蛋白質(zhì)復(fù)合體組成的分析，包括結(jié)構(gòu)型的蛋白質(zhì)復(fù)合體，如核孔復(fù)合體，這一類比較穩(wěn)定。另一種那么是功能型蛋白質(zhì)復(fù)合體，如負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體或負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的復(fù)制蛋白復(fù)合體，這類復(fù)合體只有在執(zhí)行功能時(shí)才聚合在一起，因此很不穩(wěn)定。9精選課件■單一手段與多種技術(shù)—基因組既無量的變化，也沒有質(zhì)的變化。在基因組研究中，DNA測(cè)序技術(shù)是一個(gè)最根本和最主要的工具。—蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組研究技術(shù)，可簡(jiǎn)單地分為兩大類，第一類是蛋白質(zhì)的別離技術(shù)，包括雙向電泳技術(shù)、細(xì)胞的分級(jí)別離技術(shù)、親和層析技術(shù)等蛋白質(zhì)組研究技術(shù)等。蛋白質(zhì)組別離面臨著蛋白的量和質(zhì)兩方面的難點(diǎn)。第二類是蛋白質(zhì)組的鑒定技術(shù)，其核心是質(zhì)譜技術(shù)?，F(xiàn)有鑒定技術(shù)面臨的最大問題是，它們都依賴于的蛋白質(zhì)或基因的序列作為檢測(cè)的根底，通過比較來確定待測(cè)定的蛋白質(zhì)。對(duì)于在已有的數(shù)據(jù)庫中沒有記載的全新蛋白質(zhì)進(jìn)行“從頭測(cè)定〞是一個(gè)很困難的任務(wù)?？傊?，蛋白質(zhì)組對(duì)技術(shù)的依賴和要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過基因組學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)的開展是受技術(shù)限制的，也是受技術(shù)推動(dòng)的。10精選課件■互補(bǔ)與互助—在后基因組時(shí)代，蛋白質(zhì)組研究和基因組研究依然是形影相隨的兩個(gè)重要領(lǐng)域?；蚪M與蛋白質(zhì)組之間既為互相補(bǔ)充又能互相幫助?！猰RNA是介于基因和蛋白質(zhì)之間的中間產(chǎn)物。因?yàn)閙RNA既是基因的產(chǎn)物，又比蛋白質(zhì)要容易分析，所以，研究mRNA的表達(dá)模式也是了解基因組和蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要途徑。由此專門形成了一個(gè)新的研究領(lǐng)域：轉(zhuǎn)錄組。研究轉(zhuǎn)錄組的主要手段是基因芯片技術(shù)、SAGE〔基因表達(dá)序列分析〕技術(shù)?！鞍踪|(zhì)組的許多工作也離不開對(duì)基因組的研究，在蛋白質(zhì)組的相互作用研究中表現(xiàn)尤為突出。雙雜交技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)等就是以基因組數(shù)據(jù)和技術(shù)為根底的。11精選課件蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)別離蛋白質(zhì)鑒定生物信息學(xué):蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫等基于凝膠非凝膠雙向電泳〔2DE〕微流芯片多維色譜毛細(xì)管等電聚焦質(zhì)譜技術(shù)三大支柱12精選課件雙向電泳和差異凝膠電泳

■雙向電泳〔Twodimensionelctrophresis,2DE〕是根據(jù)不同蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的不同利用第一向等電聚焦和第二向SDS電泳將蛋白質(zhì)混合物中的各種蛋白別離開?！霾町惸z電泳〔differentialgelelectrophoresis,DIGE〕是在2DE根底上建立的蛋白質(zhì)別離技術(shù)。該方法將待比較的兩個(gè)樣品蛋白質(zhì)分別用不同的熒光染料(Cy2、Cy3、Cy5)進(jìn)行標(biāo)記后，等量混合再進(jìn)行雙向電泳。由于熒光染料的發(fā)光波長(zhǎng)不同，可以在一塊凝膠上檢測(cè)兩個(gè)樣品，并通過蛋白點(diǎn)不同熒光信號(hào)間的比率確定蛋白量的差異。凝膠分離技術(shù)蛋白質(zhì)別離技術(shù)13精選課件色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜與質(zhì)譜聯(lián)用就是將蛋白質(zhì)混合物通過液相色譜別離并收集樣品中的特定組分，然后再借助質(zhì)譜進(jìn)行分析，獲得特定蛋白質(zhì)的分子量信息并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。目前，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用、反相液相色譜－離子交換色譜－反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜三維聯(lián)用等色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。非凝膠分離技術(shù)14精選課件蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

外表增強(qiáng)激光解析電離質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorptionionization-massspectrometry,SELDI-MS)就是將蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜相結(jié)合的蛋白質(zhì)圖譜分析技術(shù)。該技術(shù)可直接將血清、尿液、組織提取物等蛋白質(zhì)混合物與不同化學(xué)外表〔疏水、親水、陽離子、陰離子、金屬離子螯合〕和生物外表〔抗原－抗體、受體－配體、DNA-蛋白質(zhì)〕的蛋白質(zhì)芯片相結(jié)合而將蛋白質(zhì)別離，然后用SELDI-MS對(duì)別離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。根據(jù)質(zhì)譜圖可得到蛋白的分子量及相對(duì)強(qiáng)度，分析不同樣品的差異蛋白。與2DE相比，該方法可以檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)、需時(shí)短并適于微量樣品的分析。非凝膠分離技術(shù)15精選課件16精選課件17精選課件生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定在蛋白質(zhì)組學(xué)研究流程中，蛋白質(zhì)的鑒定是最關(guān)鍵的一環(huán)。蛋白質(zhì)鑒定的主流技術(shù)就是生物質(zhì)譜技術(shù)。就技術(shù)而言，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比核酸研究技術(shù)要相對(duì)復(fù)雜和困難得多，不僅氨基酸殘基種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于核苷酸殘基，而且蛋白質(zhì)有著復(fù)雜的翻譯后修飾如磷酸化、糖基化等，這給別離分析帶來很多困難。20世紀(jì)80年代末在生物大分子領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用的質(zhì)譜技術(shù)那么與Edman降解氨基酸測(cè)序使蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)得以說明、NMR的出現(xiàn)推進(jìn)了對(duì)蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的解釋一樣，是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的里程碑。18精選課件對(duì)蛋白質(zhì)和多肽而言，質(zhì)譜技術(shù)就是要確定一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽的分子質(zhì)量。分子質(zhì)量是一個(gè)蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸最根本的特征，這種特征是專一的。不同的氨基酸組成、不同的氨基酸序列、不同的修飾方式、不同的蛋白質(zhì)間結(jié)合方式、不同的位點(diǎn)差異都可以在蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量上得以表達(dá)。對(duì)蛋白質(zhì)以及組成蛋白質(zhì)的多肽，氨基酸的分子質(zhì)量測(cè)定實(shí)際上就是對(duì)蛋白質(zhì)種類和性質(zhì)的鑒定。質(zhì)譜技術(shù)的根本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比〔m/z〕的差異來別離并確定分子質(zhì)量。一臺(tái)質(zhì)譜儀一般由進(jìn)樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。其中，離子化源和質(zhì)量分析器是兩個(gè)中心部件，不同類型的質(zhì)譜儀主要就是根據(jù)這兩個(gè)部件命名的。19精選課件飛行時(shí)間質(zhì)譜〔TOFMS〕由離子源〔S〕引出極、漂移區(qū)〔D〕和檢測(cè)器組成。當(dāng)離子在離子源內(nèi)形成后在離子源內(nèi)電場(chǎng)E的作用下進(jìn)入無場(chǎng)漂移區(qū)。在理想狀態(tài)下，所有進(jìn)入漂移區(qū)的離子具有相同的動(dòng)能〔KE〕.測(cè)定離子在漂移區(qū)內(nèi)的飛行時(shí)間即可計(jì)算出它的質(zhì)荷比?；|(zhì)輔助激光解吸離子化是將樣品均勻包埋在固體基質(zhì)〔a－氰基－4－羥肉桂酸〕中，基質(zhì)吸收激光提供的能量而蒸發(fā)，攜帶局部樣品分子進(jìn)入氣相，并將一局部能量傳遞給樣品分子使其離子化。基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜儀〔MALDI-TOF/TOF-MS〕檢測(cè)器加速電壓＋＋＋引出極漂移管D離子源DS飛行時(shí)間質(zhì)譜示意圖20精選課件21精選課件■

質(zhì)譜法結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索對(duì)多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定這一方法的理論根底是認(rèn)為每個(gè)蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成為長(zhǎng)短不一的肽段后，同一時(shí)間獲得所有肽段分子質(zhì)量而形成一個(gè)肽段分子質(zhì)量圖譜，這一圖譜對(duì)蛋白質(zhì)應(yīng)是專一而特異的，因此肽質(zhì)量指紋圖譜〔peptidemassfingerprinting,PMF〕。這一方法不需對(duì)圖進(jìn)行人工解析，只需將實(shí)驗(yàn)獲得的PMF與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論P(yáng)MF比對(duì)，就可以鑒定該蛋白質(zhì)。因此比傳統(tǒng)方法速度快、通量高，是最早用于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜方法，也是目前最簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)鑒定方法之一。22精選課件

雙向電泳制備原那么：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)〔包括多數(shù)疏水性蛋白〕，且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾〔如酶性或化學(xué)性降解等〕。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。雙向電泳分析中的樣品制備23精選課件制備原那么：雙向凝膠電泳第一向?yàn)榈入娋劢埂睮EF〕，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行別離；第二向?yàn)镾DS凝膠電泳〔SDS〕，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行別離。所以，在樣品制備過程中，一切影響等電聚焦和凝膠電泳的因素都應(yīng)該考慮在內(nèi)。有效的可重復(fù)的樣品制備是雙向電泳成功的關(guān)鍵。24精選課件可溶性樣品

固體組織樣品

細(xì)胞不同樣品的根本處理方法樣品的分級(jí)處理通過采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行別離。25精選課件樣品的溶解溶解的目標(biāo)：1、樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液〔否那么樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降〕；2、溶解方法必須去除可能干擾2-DE別離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。是2-DE成功別離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。26精選課件增加樣品溶解性的手段為獲得最正確的雙向電泳別離結(jié)果，樣品一般使用促溶劑、去污劑、復(fù)原劑、IPG緩沖液和兩性電解質(zhì)等將其變性并充分溶解。變性劑：尿素和硫尿是最常用的變性劑，其主要作用是改變氫鍵或次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域，使得蛋白質(zhì)變性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素聯(lián)合使用，可大大增加蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性。硫脲和尿素有效地破壞了疏水鍵，防止了聚集作用和二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，聚集作用和二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成會(huì)改變蛋白質(zhì)的遷移性。27精選課件外表活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種外表活性劑來溶解疏水基團(tuán)。外表活性劑的作用主要是破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用，提高蛋白質(zhì)的溶解性，防止等電聚焦時(shí)析出。原那么上去污劑應(yīng)該是非離子型或者是兼性離子型，這樣才不會(huì)影響蛋白質(zhì)遷移到它們各自的等電點(diǎn)位置。離子型去污劑SDS不利于等電聚焦，但是SDS緩沖液可抑制蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性，所以一般只用于樣品處理的初級(jí)階段，濃度不高于0.3％時(shí)，對(duì)等電聚焦不會(huì)產(chǎn)生太大影響。非離子型去污劑TritonX-100和NP-40以前應(yīng)用較多，現(xiàn)多用兼性離子去污劑CHAPS，CHAPS比其他去污劑溶解疏水性氨基酸殘基的能力更強(qiáng)，其使用濃度一般在1％－2％。28精選課件復(fù)原劑：在變性劑和外表活性劑聯(lián)用條件下，加用復(fù)原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。復(fù)原劑主要用來斷裂蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦〔TBP〕進(jìn)行復(fù)原。其中DTT是使用比較廣泛的復(fù)原劑，在50mmol/L時(shí)能有效地復(fù)原大局部的二硫鍵。29精選課件起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和外表活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否那么這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性，吸附高濃度尿素在溶液中形成的氰酸鹽離子，離心時(shí)還有助于核酸的沉淀。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％〔w/v)。濃度過高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。30精選課件樣品液的準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)液：ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml31精選課件IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25

l250

l4-74/640%12.5

l125

l5/740%12.5

l125

l3-63/540%25

l250

l4/640%12.

l125

l5-85/840%25

l250

l7-107/940%12.5

l125

l8/1020%25

l250

lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuse32精選課件ReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparation33精選課件ReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation34精選課件樣品中核酸的去除對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)〔SCA〕同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。35精選課件亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)別離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對(duì)別離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。36精選課件亞蛋白質(zhì)組樣品的制備順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合外表活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%〔W/W〕。37精選課件特殊樣品的制備低豐度蛋白的別離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加別離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響別離。現(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行別離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的別離。38精選課件強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)〔如核糖體〕的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條〔如pH3－12、4-12或10-12〕進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠〔如pH10-12〕的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠〔如pH3-12、4-12〕等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。39精選課件一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。40精選課件一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：41精選課件等電聚焦〔IEF〕電泳就是在凝膠中參加兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：42精選課件43精選課件44精選課件一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：IPG〔(ImmobilizedpHGradient,IPG)〕膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF別離到達(dá)真正的平衡狀態(tài)。45精選課件IPG膠的重泡漲2-DE樣品重泡漲溶液重泡漲溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG緩沖液

(兩親性電解液)0.28%DTT微量

溴酚藍(lán)IPG膠條支架IPG

膠條定位泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的IEF。46精選課件蛋白載樣量影響IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析待研究蛋白的豐度樣品的復(fù)雜度復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后那么更易分析。IPG膠條的pH范圍47精選課件IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100

g/125

l200~500ug/125

l11cm50~200

g/185

l250~1000ug/185

l17cm100~300

g/300

l1~3mg/300

l48精選課件?不同長(zhǎng)度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個(gè)pH范圍?pH7-11NL堿性膠條IPGIEF中pH梯度的選擇49精選課件IPGIEF中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長(zhǎng)，預(yù)試驗(yàn)確定。寬pH梯度用于：

全部蛋白(確定感興趣蛋白

的大致位置)窄pH梯度用于：

提高分辨率增加載樣能力以檢測(cè)、分析

更多蛋白50精選課件51精選課件52精選課件53精選課件54精選課件55精選課件18-20hIPG水化上樣56精選課件杯上樣&紙橋上樣杯上樣：有些情況下，需要在水化之后加樣，然后立即進(jìn)行IEF電泳，例如，如果擔(dān)憂發(fā)生蛋白質(zhì)水解或其他蛋白質(zhì)修飾，樣本經(jīng)過過夜的水化過程就不適宜了。使用堿性ImmobilineDryStrip凝膠時(shí)，陽極樣本杯上樣可改善雙向電泳斑點(diǎn)圖像。紙橋上樣：紙橋上樣適合于非常大量的樣本和制備電泳，特別是采用堿性pH范圍時(shí)。57精選課件★IPGphor包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(20°C)和程序化電源(10000V)★可同時(shí)進(jìn)行12根膠條的等電聚焦★聚焦效果以“Vh〞數(shù)控制，可提高重復(fù)性IEF電泳58精選課件59精選課件聚焦時(shí)間的優(yōu)化

理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最正確時(shí)間是IEF別離到達(dá)穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠外表滲出〔電滲〕而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白喪失。最正確時(shí)間確實(shí)定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長(zhǎng)度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。60精選課件IEF的根本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid61精選課件兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被別離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS是電泳能順利進(jìn)行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris〔pH8.8〕緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。?第一步DTT平衡：使變性的非烷基化蛋白處于復(fù)原狀態(tài)(1x15min)1%DTT?第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamide62精選課件二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因?yàn)樵贗PG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性IEF膠〔低濃度丙烯酰胺膠〕充當(dāng)了濃縮膠。63精選課件二維SDS低熔點(diǎn)瓊脂糖64精選課件SealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgarose65精選課件InsertingtheCassette66精選課件67精選課件聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè)理想顯色劑的7S平安〔safety〕：靈敏〔sensitivity〕：簡(jiǎn)單〔simplicity〕：特異性〔specificity〕：快速〔speed〕：穩(wěn)定〔stability〕：兼容性〔synergy〕：68精選課件有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯〔PVDF〕和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。69精選課件負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快〔5~15min〕，蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。70精選課件膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。71精選課件有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來鑒定蛋白質(zhì)。72精選課件金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)〔包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等〕相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。73精選課件凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：74精選課件蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切

包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過程75精選課件實(shí)驗(yàn)方法完整蛋白質(zhì)〔如凝膠別離或色譜純化蛋白質(zhì)〕肽混合物質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量〔MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計(jì)算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫〔＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫〕肽質(zhì)量檢索未解析碎片離子檢索酶切質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略76精選課件生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳別離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得77精選課件

孫金福

豬瘟病毒感染蛋白質(zhì)組學(xué)研究

第二局部78精選課件■

CSFV是豬瘟的病原，CSF是以出血性高熱、淋巴細(xì)胞減少和免疫抑制為主要特征的傳染病。近年來，CSF多呈溫和、慢性、非典型、持續(xù)感染特征，隱性感染母豬導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

臨床病癥:發(fā)熱,白細(xì)胞減少,皮下、粘膜和內(nèi)臟器官出血CSFV感染蛋白質(zhì)組學(xué)79精選課件■

為了尋找CSFV感染、致病相關(guān)蛋白，揭示CSFV的致病機(jī)制,本研究用高通量蛋白質(zhì)組技術(shù)——2DE、2DDIGE和質(zhì)譜鑒定分析了感染CSFV體外細(xì)胞PK-15、體內(nèi)細(xì)胞PBMC和感染豬血清的蛋白質(zhì)組變化。■目前,關(guān)于CSFV致病機(jī)制的研究多集中在病毒的自身毒力及宿主免疫反響方面，關(guān)于CSFV感染致病過程中宿主因素變化的報(bào)道較少。實(shí)際上，病毒的致病是病毒與宿主相互作用的結(jié)果，病毒的侵入會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)模式的改變，這種改變將影響宿主細(xì)胞的正常生理功能并決定病毒的致病進(jìn)程和結(jié)果。CSFV感染蛋白質(zhì)組學(xué)80精選課件CSFV感染PK-15細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析AB2081精選課件實(shí)驗(yàn)方案2-DE

圖像分析MALDI-ToFMS/MS

差異表達(dá)蛋白的驗(yàn)證差異蛋白功能注釋

裂解細(xì)胞PK-15cellsPK-15細(xì)胞

圖像分析

等電聚焦PAGE82精選課件1樣品制備與定量1.1樣品制備用豬瘟病毒石門株血毒〔1×105TCID50/0.1mL〕接種PK細(xì)胞，每瓶〔4×7mm〕細(xì)胞接種2×105TCID50。于接種病毒后48h，用細(xì)胞裂解液〔8M尿素、4％CHAPS、40mMTris、65mMDTT、10mM蛋白酶抑制劑〕裂解感染細(xì)胞，裂解液收集于1.5mL小離心管。圖1.1

簡(jiǎn)接免疫熒光法檢測(cè)CSFV感染的PK-15細(xì)胞.(A)、(B)、(C)、(D)分別為感染后24h、36h、48h、60h的細(xì)胞樣品.CDcontrolAB1.2樣品定量各實(shí)驗(yàn)組樣品經(jīng)超聲處理并離心〔20000g,15min〕后，用Bradfordassay法〔Bio-RadEttan2-DQuant試劑盒〕進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。83精選課件IPG(immobilizedpHgradient)膠條〔17cm,PH3-10,BIO-RAD)水化：適量水化液與150μg樣品混合，使總體積為350μL/strip,參加持膠槽，然后將IPG膠條放入持膠槽，防止有氣泡產(chǎn)生，放入膠條后，往膠槽加滿礦物油。在50V電壓條件下主動(dòng)水化12h－16h。膠條水化后，在50μA/strip，20℃條件進(jìn)行等電聚焦電泳。〔不同的電泳系統(tǒng)，上樣方法不同〕等電聚焦電泳程序：250V1h，500V1h，1000V1h，然后在1000V－10000V線性上升5h，10000V恒定8h，電壓時(shí)間積達(dá)80000VH。2雙向電泳〔2DE〕84精選課件■第一向電泳〔等點(diǎn)聚焦電泳〕StripsrehydrationIEF350μLrehydrationbuffercontainingofproteinsamples150μg

foreachstripe250V1h,500V1h,1000V1h,linearrampto8000Vover1h,then8000Vconstantforatotalof80000Vh.18-20h85精選課件第一向電泳后，IPGstrips置復(fù)原緩沖液中平衡15min，然后在烷基化緩沖液中平衡15min。復(fù)原緩沖液：烷基化緩沖液：50mMTris-HCl，pH8.850mMTris-HCl，pH8.86Murea,6Murea,4%w/vSDS4%w/vSDS65mMDTT53mMIodoacetamide〔碘乙酰胺〕30%glycerol30%glycerol痕量溴酚藍(lán)痕量溴酚藍(lán)膠條的平衡：86精選課件3凝膠染色SDS-PADE電泳：IPG膠條平衡后，轉(zhuǎn)移至SDS-PADE膠，進(jìn)行第二向電泳。電泳程序設(shè)置為：5mA30min，10mA30min,15mA1h，20mA1h，25mA至結(jié)束。3.1硝酸銀染色1．固定45%乙醇+5%乙酸20-30min2．水洗2min×2-60min3．敏化0.02%Na2S2O31-2min4．水洗1min×25．染色0.1%AgNO34℃20-40min6．水洗1min×37．顯色40μl甲醛+2gNa2CO3100ml一般10min以內(nèi)8．停顯1%乙酸〔不可用于質(zhì)譜分析〕EDTA-Na2終止反響(3.65g/250mlddH2O)87精選課件3.2考馬斯亮藍(lán)染1固定液〔10%甲醇，7%乙酸〕固定2h2水洗3×10min3膠體蘭染色G250〔150－200ml〕3－4h或過夜4用去離子水脫色至背景消失。4圖像采集用掃描儀〔AmershamBiosciences,U9909H7L0〕掃描凝膠，采集圖像。88精選課件48h感染48h對(duì)照銀染分析膠圖像89精選課件5圖像分析用PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析的主要步驟：◆點(diǎn)的檢測(cè)〔spotdetection)◆建立匹配組〔machset〕◆建立復(fù)制組〔replicategroup〕◆建立分析組〔analysisset〕90精選課件5圖像分析91精選課件6表達(dá)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)6.1軟件分析圖像分析顯示，各實(shí)驗(yàn)組滿足T檢驗(yàn)〔P<0.05〕，感染后48h表達(dá)差異1.5倍以上的蛋白點(diǎn)為：35個(gè)點(diǎn)

6.2人工比對(duì)對(duì)軟件分析給出的差異點(diǎn)進(jìn)行人工校對(duì)。92精選課件7.1制備膠條件優(yōu)化樣品蛋白的丙酮沉淀：1按照蛋白樣品與預(yù)冷丙酮〔含20mmolDTT〕1:3比例參加預(yù)冷丙酮溶液2－20℃沉淀2h320000g離心15min，棄上清，倒置于濾紙上4參加原體積1/3裂解液，振蕩溶解5超聲處理〔超聲0.2秒，間隔2秒，15循環(huán)，20％功率〕6離心，20000g15min7取上清8定量7差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的鑒定93精選課件考染制備膠圖像感染和對(duì)照混合樣品1.2mg621感染和對(duì)照混合樣品0.7mg62794精選課件

丙酮沉淀后對(duì)照，700mg720

丙酮沉淀后對(duì)照，＞700mg71195精選課件丙酮沉淀后感染>0.7mg730丙酮沉淀后感染0.7mg717上樣量不同96精選課件7.2制備膠切膠與膠內(nèi)酶解1切膠：用解剖刀將目的點(diǎn)切下，并將膠塊切成1mm3大小的膠粒，置EP管中。2脫色：參加脫色液100μL浸泡，振蕩20min，棄去溶液，重復(fù)1-2次洗至透明。3凍干：棄脫色液，將膠粒凍干。4酶解：參加15-20μL酶液〔0.01μg/μL〕，置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，棄多余酶液，補(bǔ)充酶解緩沖液〔25mMNH4HCO3〕15-20μL，使膠完全浸沒。37℃保溫15小時(shí)或過夜?！沧ⅲ簳r(shí)間不要太長(zhǎng)〕5蛋白提取：吸出酶解液，移至新EP管，原管加提取液Ⅰ〔5%TFA〕100μL，40℃加熱水浴45min時(shí)，超聲3min左右，再水浴45min。吸出提取液與酶解液合并，然后向膠塊中參加提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保溫1小時(shí)，30min時(shí)，超聲3min左右，吸出提取液與前液合并，氮?dú)獯蹈梢译婧?，冰凍枯燥。?0℃保存用于質(zhì)譜鑒定。97精選課件8質(zhì)譜鑒定樣品－基質(zhì)的準(zhǔn)備與點(diǎn)靶：凍干的蛋白樣品用0.1%TFA溶解〔一般2.5μL左右〕，然后在靶上點(diǎn)樣。①Dried-Droplet法：飽和的基質(zhì)溶液與蛋白質(zhì)溶液混合〔5000:1〕，0.5-2μL混合液點(diǎn)到靶體上。②Thin-Layer法：均一的基質(zhì)層首先在靶體上形成，然后樣品加在其上。③先加樣品，再加基質(zhì)。樣品點(diǎn)0.8-1μL，可分屢次點(diǎn)樣。點(diǎn)完樣品后，點(diǎn)基質(zhì)0.6μL，一次點(diǎn)樣即可。98精選課件■全面分析了宿主細(xì)胞感染CSFV病毒后蛋白質(zhì)的整體表達(dá)模式。在對(duì)照和感染樣品中，每塊凝膠檢測(cè)到1300多個(gè)蛋白點(diǎn)。在病毒感染后48h，通過軟件分析，滿足T檢驗(yàn)〔P<0.05〕、至少有1.5倍以上的差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)共有35個(gè)?！鲈陲@著差異表達(dá)的蛋白中，用串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOFMS/MS)共鑒定了21個(gè)蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)表達(dá)蛋白16個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白5個(gè)。根據(jù)差異表達(dá)蛋白的功能，，根據(jù)蛋白功能可以分為細(xì)胞骨架、細(xì)胞能量代謝、抗氧化應(yīng)激、核酸復(fù)制/轉(zhuǎn)錄/翻譯、蛋白加工、信號(hào)傳導(dǎo)以及熱休克蛋白等7個(gè)類群。9PK-15細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析結(jié)果99精選課件InfectionInfectioncontrolInfectioncontrolInfectioncontrolAnnexin2GAPDHcontrol

Resultof

Proteomeanalysis(PK-15cells)100精選課件■

感染與復(fù)制相關(guān)蛋白膜聯(lián)蛋白annexin2是一個(gè)鈣依賴的胞質(zhì)蛋白，能與胞膜結(jié)合。參與多種病毒的感染、復(fù)制、裝配、出芽與釋放。比方，annexin2介導(dǎo)巨細(xì)胞病毒的感染；在人上皮細(xì)胞，annexin2是呼吸道合胞病毒的受體;巨嗜細(xì)胞annexin2與HIV1糖蛋白Gag結(jié)合，并且annexin2下調(diào)表達(dá)可顯著抑制HIV復(fù)制。Annexin2在CSFV感染細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，說明其可能對(duì)CSFV感染和復(fù)制發(fā)揮著一定的作用。

差異表達(dá)蛋白的功能意義101精選課件不均一核糖核酸蛋白〔hnRNPs〕是一類核RNA結(jié)合蛋白，具有參與轉(zhuǎn)錄、mRNA運(yùn)輸與剪接、mRNA穩(wěn)定性等功能。研究說明一些hnRNPs蛋白參與病毒的RNA合成和加工，比方，hnRNPA1參與丙型肝炎病毒〔HCV〕的復(fù)制，調(diào)節(jié)鼠肝炎病毒RNA合成，幾種hnRNPs蛋白還參與人獲得性免疫缺陷病毒〔HIV〕的RNA代謝和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)?！?/p>

感染與復(fù)制相關(guān)蛋白

差異表達(dá)蛋白的功能意義102精選課件■

感染與復(fù)制相關(guān)蛋白

差異表達(dá)蛋白的功能意義翻譯延長(zhǎng)因子1δ(EF-1δ)在感染樣品中顯著上調(diào)表達(dá)。真核翻譯延長(zhǎng)因子在幾種病毒的復(fù)制和致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。如與WNV、登革熱4型病毒、HCV、HIV-1、BVDV等病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，促進(jìn)病毒的復(fù)制或抑制宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)。103精選課件■

細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

差異表達(dá)蛋白的功能意義糖酵解酶磷酸甘油酸變位酶1〔PGAM1〕上調(diào)表達(dá)、三磷酸甘油醛脫氫酶〔GAPDH〕下調(diào)表達(dá)。除了能量代謝功能之外，PGAM的活性增強(qiáng)可抵抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞無限增殖；GAPDH是細(xì)胞凋亡的通用介導(dǎo)蛋白，與細(xì)胞凋亡有關(guān)，GAPDH上調(diào)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡?？寡趸瘧?yīng)激蛋白〔PRDX6,thioredoxin-like〕上調(diào)表達(dá),thioredoxin和PRDX6在細(xì)胞中過量表達(dá)能夠抵抗氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡。以上凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，抑制了細(xì)胞的凋亡，為病毒提供了持續(xù)繁殖的場(chǎng)所，實(shí)現(xiàn)了持續(xù)感染。104精選課件Peptidyl-prolylcis-transisomeraseA(cyclophilinA)playsanimportantroleindenovoproteinfoldingandinisomerizationofnativeproteinsinseveralcellularsystems.Inaddition,cyclophilinAinteractswithHCVRNAaswellastheviralpolymerase,andisanessentialcellularcofactorforHCVreplicationandinfection.46GrowingevidenceindicatesthattheimmunosuppressantcyclosporinA(CsA)-targetedcellularcyclophilincanstronglysuppressthereplicationofHCVinvitroorinvivo.BothHCVandCSFVaremembersoftheFlaviviridae,andhaveasimilargenomestructure;therefore,upregulationofcyclophilinAinCSFV-infectedsamplessuggeststhatcyclophilinAmayalsoplayacriticalroleinCSFVreplication.105精選課件PK-15細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析106精選課件CSFV感染豬PBMC蛋白質(zhì)組分析裂解細(xì)胞

二維電泳

CSFV感染豬PBMC

分離外周血白細(xì)胞凋亡和T細(xì)胞亞群動(dòng)力學(xué)檢測(cè)107精選課件外周血白細(xì)胞凋亡、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化動(dòng)力學(xué)

攻毒后豬外周血白細(xì)胞總數(shù)顯著減少，白細(xì)胞凋亡顯著高于對(duì)照組，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群急劇下降，說明CSFV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是免疫細(xì)胞減少和免疫抑制的主要原因。108精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果感染的PBMC樣品中共有73個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定了其中51個(gè)蛋白點(diǎn)，屬于34種特定蛋白。根據(jù)差異表達(dá)蛋白的功能可以分為細(xì)胞骨架、能量代謝、抗應(yīng)激蛋白、核酸復(fù)制/轉(zhuǎn)錄/翻譯、蛋白加工等5個(gè)功能類群。

109精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果Westernbloting比較分析cofilin和annexinA1在CSFV感染豬PBMC和對(duì)照樣品的表達(dá)水平110精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■細(xì)胞骨架紊亂多種細(xì)胞骨架蛋白包括肌動(dòng)蛋白、膜突蛋白、粘著斑蛋白、膜聯(lián)蛋白A1、踝蛋白等蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化〔上調(diào)或下調(diào)〕。共有7個(gè)不同的蛋白點(diǎn)鑒定為β肌動(dòng)蛋白或肌動(dòng)蛋白亞型，4個(gè)不同的蛋白點(diǎn)鑒定為膜聯(lián)蛋白annexinA1。具有不同分子量、等電點(diǎn)的蛋白點(diǎn)被鑒定為同一種蛋白，可能是CSFV感染誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞骨架蛋白的解聚、降解或不同程度的翻譯后修飾，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的紊亂、崩解。肌動(dòng)蛋白骨架完整性的喪失與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系。肌動(dòng)蛋白骨架紊亂能夠激活細(xì)胞凋亡蛋白酶-3(caspase-3)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

111精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■感染與復(fù)制相關(guān)蛋白膜突蛋白是細(xì)胞骨架重塑相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，能夠調(diào)節(jié)穩(wěn)定微管的形成，在感染樣品顯著上調(diào)表達(dá)。在HIV-1感染的T細(xì)胞系CEM和H9細(xì)胞中，膜突蛋白上調(diào)表達(dá)，與HIV囊膜糖蛋白gp120結(jié)合，這種結(jié)合可能在病毒的攝入、裝配和出芽過程中發(fā)揮著重要的作用。與膜輔蛋白CD46相互結(jié)合形成麻疹病毒（meslesvirus,MV）的受體復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)MV的攝入。翻譯延長(zhǎng)因子1α(EF-1α)在感染樣品中顯著上調(diào)表達(dá)，與體外PK-15相似。112精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白粘著斑蛋白參與調(diào)節(jié)與細(xì)胞生存和凋亡有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)途徑，有研究顯示在凋亡細(xì)胞中粘著斑蛋白上調(diào)表達(dá)，而在高度惡化和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中粘著斑蛋白缺失或顯著下調(diào)表達(dá)。粘著斑蛋白在感染樣品中上調(diào)表達(dá)，顯示CSFV誘導(dǎo)了PBMC的凋亡。GAPDH上調(diào)表達(dá)8倍，而在體外PK-15細(xì)胞顯著下調(diào)表達(dá)?？寡趸锩窹rx-1下調(diào)表達(dá)，Prx-1參與信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（signal-regulatingkinase1,ASK1)信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，并在該凋亡途徑中發(fā)揮著抑制凋亡的作用。

113精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■免疫相關(guān)分子血小板反應(yīng)素1（Thrombospondin1，TSP-1)

，除參與凝血機(jī)制外，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，比如，TSP-1調(diào)節(jié)T細(xì)胞行為并參與炎性T細(xì)胞的激活和克隆增殖。有證據(jù)表明，敲除TSP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)細(xì)菌性肺臟感染較敏感，顯示了TSP-1對(duì)宿主免疫反應(yīng)的作用。TSP-1顯著下調(diào)，可能干擾T細(xì)胞的免疫功能?？寡趸鞍椎纳险{(diào)表達(dá)有助于增強(qiáng)CD8(+)T細(xì)胞的抗病毒活性，在HIV感染活化的CD8(+)T細(xì)胞中，過氧化物氧化還原蛋白家族成員NKEF-A和NKEF-B上調(diào)表達(dá)。本研究中，Prx-1顯著下調(diào)表達(dá)，可能會(huì)影響CD8(+)T細(xì)胞的抗病毒活性。

114精選課件CSFV感染豬血清差異蛋白質(zhì)組分析2D-DIGECSFV感染豬血清分離

血清標(biāo)記

去除高豐度蛋白115精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析

由于血清/血漿樣本易于采集，并且含有細(xì)胞和組織分泌的數(shù)千種蛋白，血清/血漿中蛋白成分的動(dòng)力學(xué)變化反映著機(jī)體細(xì)胞、組織的病理生理狀態(tài)，因此血清/血漿是最有價(jià)值的尋找蛋白標(biāo)記的樣品。在人的腫瘤、病毒性疾病的血清蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)了一系列的疾病相關(guān)蛋白標(biāo)記，建立了一些新的診斷方法。

116精選課件Cy2(紅色)標(biāo)記混合內(nèi)標(biāo)對(duì)照樣品；Cy3(藍(lán)色)標(biāo)記感染血清樣品；Cy5(綠色)標(biāo)記對(duì)照血清樣品。白色的點(diǎn)說明該蛋白在三種樣品的含量是相等的，紫色的點(diǎn)說明該蛋白在感染血清中上調(diào)表達(dá)，綠色的點(diǎn)說明該蛋白在感染血清中下調(diào)表達(dá)。

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果117精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果

發(fā)現(xiàn)了17個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，用質(zhì)譜鑒定了14個(gè)差異表達(dá)蛋白。這些差異表達(dá)的血清蛋白反映了CSFV感染豬組織、細(xì)胞的生理狀態(tài)的變化，進(jìn)一步的評(píng)價(jià)分析將有可能發(fā)現(xiàn)與致病機(jī)制相關(guān)的信息或新型診斷標(biāo)記。

118精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果接聯(lián)球蛋白屬于急性期蛋白，可抑制炎性反響造成的損傷。在急性和慢性炎癥、病毒感染以及腫瘤等疾病中，血清接聯(lián)球蛋白的水平會(huì)提高。除此之外，接聯(lián)球蛋白還具有刺激血管生成和組織修復(fù)的生物功能。CSFV感染可造成血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷，接聯(lián)球蛋白水平在感染血清中降低，可能不利于炎癥損傷的控制和血管內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致宿主皮下、內(nèi)臟器官粘膜出血。119精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果凝血酶抑制因子亞型2的水平顯著下調(diào)，凝血酶是一個(gè)絲氨酸蛋白酶，在凝血級(jí)聯(lián)反響和止血過程中發(fā)揮著核心的作用。此外，凝血酶控制內(nèi)皮組織對(duì)損傷的增生、修補(bǔ)反響，促進(jìn)促炎癥反響和促凝血內(nèi)皮系統(tǒng)反響。在CSFV感染豬的血清中，凝血酶抑制因子亞型2的水平顯著下調(diào)，可能誘導(dǎo)了凝血機(jī)制的紊亂，造成毛細(xì)血管彌漫性凝血。120精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果載脂蛋白AI是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白，由肝臟和腸道產(chǎn)生，在膽固醇的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要的作用，還具有抗炎癥、抗氧化劑、修復(fù)人的內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙的作用。apoAI的水平顯著下調(diào)，可能不利于炎癥反響的控制和血管內(nèi)皮系統(tǒng)的功能修復(fù)。121精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果與免疫有關(guān)的補(bǔ)體C4的亞基C4a、免疫球蛋白γ鏈兩種蛋白在CSFV感染血清中下調(diào)表達(dá)。補(bǔ)體系統(tǒng)失調(diào)與凝血系統(tǒng)的功能障礙等疾病有關(guān)。補(bǔ)體成分是炎癥反響的重要調(diào)節(jié)因子，并促進(jìn)免疫反響的調(diào)節(jié)C4是補(bǔ)體經(jīng)典途徑的主要成分，感染血清C4a的下調(diào)，可能對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和機(jī)體的免疫反響以及凝血系統(tǒng)造成不良影響。

差異表達(dá)蛋白中的一些蛋白如接聯(lián)珠蛋白、載脂蛋白AI

及C4a被鑒定為其它疾病的生物標(biāo)記，這些差異表達(dá)蛋白作為CSFV感染生物標(biāo)記的潛在可能性還需進(jìn)一步的評(píng)估。122精選課件■用2-DE、2DDIGE和質(zhì)譜鑒定等高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)CSFV感染蛋白質(zhì)組進(jìn)行了系統(tǒng)分析，獲得了迄今最為完善的CSFV感染體內(nèi)外宿主細(xì)胞、宿主血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)?！鲨b定了一些可能的CSFV感染、復(fù)制與致病相關(guān)宿主蛋白和可能的抑制和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的細(xì)胞途徑。為CSFV致病機(jī)制和新型預(yù)防、治療靶標(biāo)以及診斷標(biāo)記的進(jìn)一步研究奠定了根底，提供了研究素材。

結(jié)論123精選課件病毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展病毒病原生態(tài)與分子流行病實(shí)驗(yàn)室第三局部124精選課件■

病毒粒子蛋白質(zhì)組■

病毒感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組變化■

病毒感染宿主血清蛋白質(zhì)組125精選課件1

病毒粒子蛋白質(zhì)組研究◆

全面了解病毒粒子的蛋白質(zhì)組成是研究病毒生物學(xué)功能以及特定病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的前提。◆有些病毒粒子中含有非病毒編碼的宿主細(xì)胞蛋白，這些宿主蛋白反映了病毒在細(xì)胞不同的細(xì)胞器或細(xì)胞亞單位進(jìn)行復(fù)制、裝配和釋放的可能過程；◆有些病毒粒子中的宿主細(xì)胞蛋白，在病毒的生命循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，又非病毒基因組編碼，沒有突變的壓力，可以作為良好的抗病毒治療候選靶標(biāo)。如HIV-1病毒粒子中的宿主細(xì)胞蛋白CyclophilinA(CypA)，在病毒的復(fù)制中發(fā)揮著必不可少的作用。

126精選課件病毒粒子蛋白質(zhì)組分析技術(shù)路線127精選課件以痘苗病毒為例，有多個(gè)小組用不同方法分析了其蛋白質(zhì)組成。早在1996年，Jensen等用2DE和MALDI-TOF-MS分析了痘苗病毒的蛋白質(zhì)組，共鑒定13個(gè)病毒編碼蛋白，5個(gè)細(xì)胞蛋白。Chung等〔2006〕用LC/MS/MS技術(shù)鑒定了痘苗病毒粒子〔IMV〕包括結(jié)構(gòu)蛋白、酶和轉(zhuǎn)錄因子等在內(nèi)的75個(gè)病毒蛋白和23個(gè)宿主細(xì)胞蛋白，病毒蛋白中有10種蛋白是新發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白，其中7個(gè)蛋白(E6R,G3L,L3L,A6L,A15L,A31R,andC6L)是以前推測(cè)的ORFs產(chǎn)物，3個(gè)蛋白(K4L,G9R,A16L)的功能和定位是以前所未知的。Yoder等〔2006〕用五種不同組合的方法鑒定了痘苗病毒粒子63個(gè)病毒編碼蛋白，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)由以前未知的閱讀框編碼蛋白〔E6R和L3L〕。128精選課件

上述研究用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了許多以前未知的病毒編碼蛋白或未注釋的ORFs的產(chǎn)物以及宿主細(xì)胞蛋白。由結(jié)果可知，不同的蛋白質(zhì)組方法研究同一種病毒粒子蛋白質(zhì)組的結(jié)果不盡相同，說明不同的方法具有互補(bǔ)性。迄今為止，已報(bào)道了包括痘苗病毒、腺病毒、人巨細(xì)胞病毒、鼠巨細(xì)胞病毒、HIV、SARSCoV等11種病毒的蛋白質(zhì)組研究。129精選課件病毒成功實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的感染并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制需要克服多重障礙，一方面要克服細(xì)胞對(duì)病毒感染產(chǎn)生的各種免疫防衛(wèi)反響；另一方面要阻斷或影響宿主細(xì)胞的正常循環(huán)機(jī)制，利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量合成病毒自身物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)病毒的復(fù)制。因此，病毒感染必然會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組變化，這種變化又反映了病毒介導(dǎo)的宿主細(xì)胞生理功能的變化，反映了病毒的感染及其致病的進(jìn)程。所以，進(jìn)行病毒感染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究是揭示病毒與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)和治療方法的重要手段。2病毒感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組變化130精選課件2.1比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)路線131精選課件◆二維差異凝膠電泳〔2Ddifferentialgelelectrophoresis,2DDIGE〕別離技術(shù)克服了傳統(tǒng)2DE存在的膠與膠之間的差異以及傳統(tǒng)的銀染等染色方法線性范圍窄等缺陷，提高了結(jié)果的重復(fù)性、準(zhǔn)確性，因此，目前應(yīng)用較多。◆常用的標(biāo)記定量質(zhì)譜技術(shù)包括體外標(biāo)記ICAT(isotope-codedaffinitytag)和體內(nèi)標(biāo)記SILAC[5](stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)等技術(shù)，ICAT技術(shù)是用輕、重兩種試劑與蛋白質(zhì)分子的半胱氨酸殘基的－SH基團(tuán)反響，標(biāo)記不同蛋白樣品?！鬝ILAC技術(shù)主要是在培養(yǎng)細(xì)胞的介質(zhì)中參加用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的某一種必需氨基酸，在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中摻入標(biāo)記的氨基酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品蛋白質(zhì)的標(biāo)記。2.2蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)的特點(diǎn)比較132精選課件◆這些技術(shù)方法各有其優(yōu)勢(shì)和局限性，聯(lián)合使用可實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。與ICAT相比，SILAC技術(shù)省去了標(biāo)記化學(xué)反響和別離純化等繁瑣步驟，但只能用于體外培養(yǎng)細(xì)胞，不能用于組織來源的蛋白質(zhì)樣品分析，ICAT那么不能檢測(cè)沒有半胱氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子?！?DDIGE在檢測(cè)極端分子量和等電點(diǎn)以及低豐度蛋白方面存在局限性，但具有能夠檢測(cè)翻譯后修飾的不同蛋白亞型的優(yōu)勢(shì)。；◆ICAT和SILAC兩種技術(shù)雖在檢測(cè)低豐度蛋白方面有強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，但不能檢測(cè)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾亞型?！魹榱撕?jiǎn)化上述化學(xué)標(biāo)記定量方法的繁瑣性和消除因標(biāo)記效率等因素造成的定量誤差，建立了無需樣品標(biāo)記〔label-free〕的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組新方法，并在實(shí)踐中陸續(xù)得到應(yīng)用。2.2蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)的特點(diǎn)比較133精選課件2.3在蛋白質(zhì)水平全面揭示宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)模式

◆Mannová等用2DE、SILAC兩種方法分析了HCV感染細(xì)胞Huh7的脂筏〔lipidrafts〕蛋白質(zhì)組變化。兩種方法共鑒定了189個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些蛋白大多數(shù)與囊泡和蛋白運(yùn)輸以及細(xì)胞信號(hào)有關(guān)。用siRNA抑制上調(diào)表達(dá)蛋白R(shí)hoA、Rab9A、syntaxin7、Bax和Cdc42的表達(dá)，分析其對(duì)HCV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，抑制Cdc42和RhoA表達(dá)會(huì)提高HCV的復(fù)制，而抑制突觸融合蛋白7〔syntaxin7〕的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致HCV復(fù)制的降低。抑制Rab9A和Bax的表達(dá)，對(duì)HCV復(fù)制沒有影響。134精選課件2.3在蛋白質(zhì)水平全面揭示宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)模式

◆Jiang等在SARS冠狀病毒〔SARS-CoV〕感染的veroE6細(xì)胞系鑒定了186個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白。西尼羅河病毒〔WNV〕感染原代神經(jīng)元細(xì)胞，誘導(dǎo)55個(gè)蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，其中的9種鑒定為凋亡相關(guān)蛋白。人獲得性免疫缺陷病毒1型〔HIV-Ⅰ〕LAI株感染CD4+CEMx174細(xì)胞系，在病毒產(chǎn)量頂峰期，有687種蛋白的表達(dá)豐度發(fā)生變化，這些蛋白多數(shù)參與泛素化、核質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞循環(huán)等重要生命循環(huán)和代謝通路。135精選課件◆HIV-1的感染可致CD4＋T細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致免疫缺陷綜合征〔AIDS〕。但矛盾的是CD4＋T細(xì)胞又是HIV-1病毒的主要繁殖場(chǎng)所，并且有一小局部CD4＋T細(xì)胞長(zhǎng)期存活，持續(xù)生產(chǎn)完整的病毒粒子，這種持續(xù)感染機(jī)制尚不清楚。◆蛋白質(zhì)組分析說明，HIV-1Tat蛋白使T細(xì)胞的7種細(xì)胞骨架蛋白或與細(xì)胞骨架重組相關(guān)的蛋白下調(diào)表達(dá)，這些蛋白的下調(diào)表達(dá)使宿主細(xì)胞防止了細(xì)胞骨架的重組，保持了細(xì)胞的完整，從而抑制了細(xì)胞凋亡，使HIV感染細(xì)胞成為長(zhǎng)期的和持續(xù)的病毒粒子生產(chǎn)場(chǎng)所，實(shí)現(xiàn)了HIV的持續(xù)性感染。2.4.1

HIV病毒持續(xù)感染機(jī)制

2.4揭示病毒的分子致病機(jī)制

136精選課件關(guān)于感染野生型狂犬病毒〔RV〕和弱毒RV小鼠的蛋白質(zhì)組分析顯示與離子平衡有關(guān)的蛋白H+ATP酶和Na+/K+ATP酶上調(diào)表達(dá)，而Ca2+ATP酶下調(diào)表達(dá)，參與突觸泡與突出前膜對(duì)接或融合的相關(guān)蛋白〔alpha-synaptosome-associatedprotein(SNAP),tripartitemotif-containing9(TRIM9),syntaxin,andpallidin〕下調(diào)表達(dá)，這些蛋白的下調(diào)表達(dá)，可能導(dǎo)致了神經(jīng)機(jī)能障礙。另外，致弱的RV感染介導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)表達(dá)，這些數(shù)據(jù)解釋了為什么僅僅在弱毒RV感染的細(xì)胞或動(dòng)物才能觀察到細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。2.4.2

Rabiesvirus致病機(jī)制

137精選課件目前已報(bào)道了包括HIV、SARSCoV、EB病毒、柯薩奇病毒(CVB3)、西尼羅河病毒〔WNV〕等10余種病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)組變化的研究結(jié)果。有必要指出，蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫還很不完善，限制了對(duì)差異表達(dá)蛋白的功能注釋。因此，僅僅依靠比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定的差異表達(dá)蛋白完全說明病毒的致病機(jī)制是不現(xiàn)實(shí)的，在蛋白質(zhì)組研究獲得的大量信息根底上，還需結(jié)合其它技術(shù)方法進(jìn)一步研究差異表達(dá)蛋白在病毒感染和致病機(jī)制中的具體作用。138精選課件2.5發(fā)現(xiàn)病毒的作用靶標(biāo)

通過病毒感染亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究，可以發(fā)現(xiàn)病毒作用于細(xì)胞的靶標(biāo)蛋白?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒(KSHV)的K5蛋白，是病毒的免疫識(shí)別調(diào)節(jié)子，能夠介導(dǎo)多種跨膜蛋白的下調(diào)或降解，并能夠通過下調(diào)MHCⅠ等免