動(dòng)物胚胎工程(講稿)

動(dòng)物胚胎工程醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心第一節(jié)動(dòng)物胚胎工程概述1.概念2.研究的對(duì)象細(xì)胞動(dòng)物體外體內(nèi)2工程之一胚胎移植技術(shù)胚胎移植技術(shù)概述1胚胎移植技術(shù)的原理2胚胎移植的技術(shù)程序33一、概述（一）概念胚胎移植（embryotransfer，ET）：又稱受精卵移植，是將體內(nèi)或體外生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物早期胚胎移植到同種的生理狀態(tài)相同的雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù)，也稱借腹懷胎。提供胚胎的個(gè)體——供體（donor）接受胚胎的個(gè)體——受體（recipient）4

為了使供體♀多排卵，通常采用超排（superovulation）；

國外將常規(guī)的胚胎移植稱為超數(shù)排卵胚胎移植或稱為多排卵胚胎移植（multipleovulationandembryotransfer，MOET）；

目前，用體外生產(chǎn)胚胎（invitroproduction,IVP）技術(shù)或克隆（cloning）技術(shù)等方法也可以生產(chǎn)胚胎，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)胚胎的來源，降低了ET的成本。5二、胚胎移植歷史

胚胎移植技術(shù)是人類基于對(duì)哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生、發(fā)育規(guī)律認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，通過大量實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)應(yīng)用，逐漸發(fā)展起來的一項(xiàng)胚胎技術(shù)。

6年代成功事件實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完成人189019321933

19421951

1952195919701971

19721973197619781981198219831989

199719982000胚胎移植胚胎移植胚胎移植

胚胎移植胚胎移植

胚胎低溫長距離運(yùn)輸體外受精胚胎分割成功第一個(gè)家畜胚胎移植商業(yè)化公司成立胚胎超低溫冷凍保存國際胚胎移植協(xié)會(huì)成立性別鑒定胚胎移植成功世界上首例試管嬰兒出世胚胎干細(xì)胞系建立轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠出生哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞核移植成功通過分離X、Y精子控制后代性別獲得成功體細(xì)胞核移植成功人胚胎干細(xì)胞系建立基因打靶后的體細(xì)胞核移植成功家兔山羊大鼠綿羊小鼠奶牛豬家兔家兔小鼠牛

小鼠哺乳動(dòng)物牛人小鼠小鼠小鼠家兔

綿羊人綿羊WalterHeapeWarwick等Nicholas,JS.Warwick等Fekete和LittleWillett等KvasnichiiAV.Marden&ChangChangMC.Mullen等AlbertaLivestockTransplantsLtd

Whittingham等InternationalEmbryoTransferSocietyHare等Steptoe&EdwardsEvans&KaufmanPalmiter等McGrath&SolterJohnson等

Wilmut等Thomson等&Gearhart等McCreath等表1哺乳動(dòng)物胚胎生物技術(shù)發(fā)展主要事件簡表

7三、胚胎移植的意義科研用途：1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物和克隆動(dòng)物、核移植、胚胎切割、體外受精等獲得目的動(dòng)物

2.動(dòng)物的微生物凈化其它用途：1.稀有品質(zhì)動(dòng)物的擴(kuò)群（如高產(chǎn)奶牛和瀕危動(dòng)物)2.不孕不育癥的治療(顯微受精)8四、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)與基本原則（一）生理學(xué)基礎(chǔ)（二）胚胎移植遵循的基本原則（三）開展胚胎移植的條件9雌性動(dòng)物發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育1早期胚胎處于游離狀態(tài)2移植的胚胎具有免疫耐受性341.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)

胚胎的遺傳特性不受受體雌性動(dòng)物的影響102.胚胎移植的基本原則胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性同一解剖位置：空間環(huán)境的一致性同一生理階段：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性

同一物種：供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性胚胎的發(fā)育期限必須處于周期黃體期內(nèi)。胚胎的質(zhì)量胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響。11實(shí)驗(yàn)室條件

溫度恒定、空氣潔凈、布局合理；技術(shù)條件胚胎來源包括人員的技術(shù)水平及所需的設(shè)備；

從優(yōu)良雌性動(dòng)物獲得大量胚胎。3.開展胚胎移植的條件12五、胚胎移植的基本步驟供、受體的選擇供體的超數(shù)排卵與人工授精受體的同期發(fā)情胚胎的收集胚胎的檢查和評(píng)定胚胎的移植131.供體和受體的選擇供體應(yīng)具有遺傳優(yōu)勢供體應(yīng)具有良好的繁殖能力供體應(yīng)營養(yǎng)良好，健康無病，體質(zhì)強(qiáng)健。受體可選用非優(yōu)良品種的個(gè)體或土種雌性動(dòng)物但亦應(yīng)具有良好的繁殖性能和健康狀態(tài)，體型中上等。

供、受體發(fā)情時(shí)間應(yīng)接近或一致142.超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是一種不正常的排卵，經(jīng)外源激素處理的雌性動(dòng)物，可以改變性周期，可以超常數(shù)的排卵，甚至可以超常數(shù)十幾倍。在施行小鼠、兔子和金黃地鼠超數(shù)排卵研究中，曾有1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只免取得胚胎88枚，有1只金黃地鼠采得72枚胚胎的記錄。15

超排所用激素主要有三類。第一類是FSH（促卵泡激素）及其類似物，第二類是LH（促黃體激素）及其類似物，第三類是外源性促排卵類激素如GnRH等類似物，以及這些激素的復(fù)合制劑。

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超數(shù)排卵的意義

采用超數(shù)排卵可大大增加每次的排卵數(shù)量。在科研上可以在短時(shí)間內(nèi)取得大量的卵和胚胎，可以滿足胚胎工程研究、遺傳工程研究和建立胚胎庫的需要。大大縮短了研究周期。在生產(chǎn)中，可以提高優(yōu)秀動(dòng)物的繁殖數(shù)量，提高產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。173.同期發(fā)情

利用外源激素制劑或其它生物學(xué)手段人為地控制并調(diào)整一群雌性動(dòng)物發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情，以便有計(jì)劃地合理地組織配種，稱為同期發(fā)情或同步發(fā)情。方法縮短黃體期的前列腺素法(PG法)延長黃體期的孕酮法

18通過縮短和延長黃體期進(jìn)行同期發(fā)情縮短黃體期（PGF2α）延長黃體期（孕激素）正常發(fā)情周期正常黃體期和卵泡期19大動(dòng)物如山羊綿羊等動(dòng)物主要采用前列腺素類的激素如用15-甲基PGF2α或氯前列烯醇等激素使黃體溶解來達(dá)到同期發(fā)情的目的。小型嚙齒類動(dòng)物如小鼠可通過挑選發(fā)情母鼠與結(jié)扎公鼠交配，來達(dá)到同期發(fā)情的目的，稱為假孕母鼠.動(dòng)物的同期發(fā)情204.供體雌性動(dòng)物的配種

經(jīng)過超數(shù)排卵處理的雌性動(dòng)物發(fā)情后應(yīng)適時(shí)配種。由于超排時(shí)的生殖道環(huán)境與自然發(fā)情差異較大，為保證排出的卵子能及時(shí)受精，應(yīng)使用活率高、密度大的精液，而且輸精次數(shù)和每次輸精的有效精子數(shù)至少要增加一倍。輸精次數(shù)增加到2～3次，間隔8～10h。21定義：利用沖冼液將胚胎從生殖道內(nèi)沖出，并收集在器皿中。

5.胚胎的收集胚胎收集的時(shí)間：一般在配種后3~8d，發(fā)育至4~8細(xì)胞期后；牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期或胚泡早期進(jìn)行收集和移植。胚胎沖洗液:沖胚液現(xiàn)多用杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）、合成輸卵管液（SOF）、布林斯特液等。沖胚液可加1-5％牛血清白蛋白，也可不加；培養(yǎng)液需加入0.1-3.2％的牛血清白蛋白，或用1-50％犢牛血清代替（用前56℃30min滅活）

22胚胎收集方法:手術(shù)法輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚子宮角沖胚非手術(shù)法二通管三通管236.胚胎的檢查與鑒定

胚胎的檢查是指在體視鏡下從沖卵液回收胚胎。同時(shí)檢查胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。對(duì)發(fā)育正常的胚胎供移植或體外培養(yǎng)和保存。24

胚胎的檢查項(xiàng)目：

1、受精卵整體的形態(tài)和體積大小；

2、透明帶形狀，厚度及損傷程度；

3、發(fā)育正常胚胎的卵裂球應(yīng)該具有整齊的外形，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚齡一致；

4、卵細(xì)胞表面顆粒的狀態(tài)和多少等。25

1（Ａ）級(jí)：優(yōu)秀。胚胎細(xì)胞團(tuán)呈均勻?qū)ΨQ的球形，單個(gè)卵裂球（或細(xì)胞）的大小、顏色、密度一致，胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一致。不規(guī)則的細(xì)胞相對(duì)較少。至少有85%的細(xì)胞物質(zhì)是完整的、具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。這些判斷是以在卵周隙中突出細(xì)胞與正常胚胎細(xì)胞的百分比為基礎(chǔ)的。透明帶必須是光滑的而不應(yīng)是凹陷的或平坦的，否則會(huì)使胚胎黏附于培養(yǎng)皿或細(xì)管上。

2（Ｂ）級(jí)：良好。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞的顏色和密度存在一定的不規(guī)則。至少有50%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。

3（Ｃ）級(jí)：質(zhì)差。胚胎細(xì)胞團(tuán)的大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞的顏色和密度存在嚴(yán)重的不規(guī)則。至少有25%的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好的、具有活性的胚胎細(xì)胞團(tuán)。

4（Ｄ）級(jí)：死亡或退化。退化的胚胎、卵母細(xì)胞或1細(xì)胞胚胎，沒有活力。

胚胎質(zhì)量分級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)267.胚胎的移植

胚胎的移植也有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式，手術(shù)法一般用于所有的動(dòng)物，主要用于小動(dòng)物。而非手術(shù)法僅適用于牛、馬及鹿等大動(dòng)物。27傳統(tǒng)的胚胎移植主要由以下一些步驟組成：

1.超數(shù)排卵

2.同期發(fā)情

3.胚胎收集和預(yù)處理

4.胚胎移植以小鼠為例：281.結(jié)扎公鼠的制備

為了獲得同步發(fā)情的假孕母鼠，要準(zhǔn)備結(jié)扎公鼠，通常選用5周齡公鼠做手術(shù)，分籠飼養(yǎng)，每籠一只。術(shù)后2～3周即完全康復(fù)，可用其生產(chǎn)假孕母鼠。目的：為了產(chǎn)生同期發(fā)情的母鼠29302.超數(shù)排卵腹腔注射PMSG10U，一般選擇在中午注射，間隔48小時(shí)后注射HCG，光照周期保持12～14h，31將注射HCG后的母鼠與正常公鼠合籠，并于第二天早上檢查陰道栓，如果見栓說明已經(jīng)配上種了，計(jì)做懷孕0天。受體母鼠(普通發(fā)情母鼠)與結(jié)扎公鼠合籠，第二天早上檢查陰道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植。3.同期發(fā)情32計(jì)算時(shí)間334.胚胎收集和預(yù)處理（1）受精卵的收集和處理見栓當(dāng)日的胚胎處于1細(xì)胞期。以脫頸椎法殺死母鼠，暴露子宮、輸卵管；剪下子宮、輸卵管，并置于平皿中；在滅菌平皿中剪下輸卵管置入盛有沖卵液的集卵杯中，在體視顯微鏡下撕開壺腹部，釋放受精卵并用用新鮮的培養(yǎng)液洗1–2次。34用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán)35

（2）2～8細(xì)胞胚胎的收集

交配后20–60小時(shí)，輸卵管中存在有2–8細(xì)胞期胚胎。此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)脫掉，可用1ml的注射器自輸卵管傘口沖得胚胎。其基本步驟如下：取輸卵管，在體視顯微鏡下找到輸卵管傘口，傘口呈平截狀，周邊略顯粗糙。然后，用鑷子輕輕夾住傘口下部位，慢慢將沖卵針插入傘口，再用鑷子輕輕夾住針頭，推壓注射器，胚胎從另一端沖出。洗滌胚胎：收集沖得的胚胎，用新鮮的培養(yǎng)液洗1–2次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)過程。沖卵36（3）桑葚胚與囊胚的收集

交配后60–72小時(shí)，一些致密的8細(xì)胞胚胎已進(jìn)入子宮。而桑椹胚和囊胚的收集則一定要從子宮中獲得。375.胚胎移植（1）輸卵管移植

根據(jù)胚胎數(shù)，確定供胚胎移植的受體母鼠數(shù)，并做好手術(shù)準(zhǔn)備。手術(shù)切口位于兩側(cè)腰部距背正中線1cm處，左右各一個(gè)相互平行的切口。3839小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手術(shù)剪切開小鼠的皮膚、肌肉、打開腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪墊，并用鑷子夾住脂肪組織，把卵巢、輸卵管和一部分子宮角慢慢拉出，通過用紗布保護(hù)的切口置于紗布上。4041在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸取胚胎，次序?yàn)槭炗?、空氣?、培養(yǎng)液、空氣泡2、胚胎(盡可能少帶入培養(yǎng)液)。空氣泡3、培養(yǎng)液。42（2）子宮移植

麻醉、剪毛、消毒；背部近中線處，最后肋骨水平上，縱向切開皮膚、腹壁，在白色脂肪體上方開一小口剪開腹膜，用鈍鑷子夾住脂肪體，從切口拉出，繼之卵巢、輸卵管、子宮相繼被拉出，并小心地移入體視顯微鏡下。43用鈍鑷子輕輕夾往子宮上端，并用針頭其下的子宮壁上扎1小孔。注意不要觸及血管。并保證針扎入子宮內(nèi)腔。輕輕拔出針頭，沿該孔將移植管插入約0.5cm，輕輕吹吸管，使培養(yǎng)液后面的氣泡達(dá)到吸管末端。這時(shí)，所有的胚胎就已移入子宮內(nèi)。子宮、卵巢、輸卵管推回腹腔，復(fù)位、縫合。44

五、ET存在的主要問題胚胎來源有限缺乏熟練的技術(shù)人員胚胎冷凍技術(shù)不完善費(fèi)用高、要求高手術(shù)法容易出現(xiàn)粘連的問題45工程之二：胚胎培養(yǎng)46胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)開始之前，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和所用的培養(yǎng)器具進(jìn)行徹底清洗、滅菌、清除可能的殘存的細(xì)胞毒性物質(zhì)。培養(yǎng)液的組成，包括水、無機(jī)離子、有機(jī)成分、能源物質(zhì)、pH值、滲透壓等對(duì)胚胎發(fā)育均有很大影響。現(xiàn)代培養(yǎng)液分為如Whitten氏液、Brinster液、BMOC－3和CZB液等簡單培養(yǎng)液和TCM－199、CMRL1066、Ham氏液和DMEM液等復(fù)雜培養(yǎng)液兩類。47胚胎培養(yǎng)方法即微滴培養(yǎng)法、輸卵管培養(yǎng)法和中間受體培養(yǎng)法。微滴培養(yǎng)法是利用塑料平皿制成50μl培養(yǎng)液小滴數(shù)個(gè)，每滴加入一定數(shù)量胚胎，在上面覆以滅菌且平衡好的液體石蠟?；蛳葘⒁后w石蠟倒入平皿中，用注射器吸培養(yǎng)液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后將培養(yǎng)皿放到5％CO2、95％空氣飽和濕度的37.5℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需要的時(shí)間。如果更換培養(yǎng)液，應(yīng)在實(shí)體顯微鏡下，用注射器或口控微吸管將培養(yǎng)液吸出，并加入新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。輸卵管培養(yǎng)法取發(fā)情動(dòng)物的輸卵管洗滌后，置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液面超過輸卵管，將同種或異種動(dòng)物的胚胎自傘口注入輸卵管，進(jìn)行培養(yǎng)。中間受體培養(yǎng)法是指，操作后的胚胎可將受精卵或早期胚胎移入同種或異種動(dòng)物的胚胎，該方法沒有種屬特異性，但為了在培養(yǎng)后容易找到胚胎和對(duì)胚胎的保護(hù)，一般先用瓊脂包埋后再培養(yǎng)。48胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)法即空氣干燥法和熒光染色法。空氣干燥法是將胚胎放入1％檸檬酸鈉溶液中低滲10－20分鐘，盡量少帶液體，將胚胎吸到潔凈載片上，再用固定液固定。空氣干燥后，經(jīng)Giemsa染色、計(jì)數(shù)。熒光染色法可以廣泛應(yīng)用于牛、羊、倉鼠、小鼠、兔子、豬等胚胎計(jì)數(shù)，常用的染料有Hoechest33342，復(fù)染液為用2.3％檸檬酸鈉配制的0.1％或0.01％的臺(tái)盼藍(lán)（TB）液。49embryoonDay3ofcultureembryoonDay5ofculture50工程之三：胚胎保存常溫保存低溫保存異種活體保存胚胎冷凍保存51

胚胎冷凍保存是采取特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使胚胎在-196℃的條件下停止代謝，而升溫后又恢復(fù)活力的一種長期保存胚胎的技術(shù)。52常用工具：冷凍管53方法：避免形成冰晶，破壞胚胎細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)1.慢速降溫法2.快速降溫法（1）三步法（2）兩步法54保護(hù)劑：甘油，1,2-丙二醇，DMSO儀器（慢速冷凍）：大型凍存儀55胚胎凍存的意義：能夠使優(yōu)秀品種品系(包括珍稀和瀕危動(dòng)物)的種質(zhì)得到長期保存下來，逐步地可以將生物界的所有生命基因長期保存起來，防止基因丟失。并且可以隨時(shí)復(fù)蘇、繁殖品系動(dòng)物，在遺傳理論指導(dǎo)下，可改良品種和培育新品種及品系。56工程之四：胚胎分割

由于發(fā)育初期胚胎細(xì)胞具有全能性，采用合適的方法把胚胎分成兩個(gè)或多個(gè)部分，每一部分都具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力，為胚胎中單個(gè)卵裂球的全能性，培育遺傳型相同的動(dòng)物做了初步探索。57（一）胚胎分割

胚胎分割：運(yùn)用顯微操作系統(tǒng)將哺乳動(dòng)物附植前胚胎分成若干個(gè)具有繼續(xù)發(fā)育潛力部分的生物技術(shù)，從而可獲得同孿生后代。（一）發(fā)展史年代胚胎細(xì)胞數(shù)動(dòng)物19042-細(xì)胞

蛙類19302-細(xì)胞

家兔19702-細(xì)胞

小鼠19804-細(xì)胞、8-細(xì)胞

綿羊4-細(xì)胞

牛58（二）胚胎分割的基本程序分割器具的準(zhǔn)備胚胎預(yù)處理胚胎分割分割胚的培養(yǎng)分割胚的保存和移植體視顯微鏡倒置顯微鏡顯微操作儀桑椹胚之前的胚胎分割桑椹胚和囊胚的分割59（二）胚胎切割技術(shù)

1.切割器具的準(zhǔn)備

胚胎分割需要的器械有體視顯微鏡，倒置顯微鏡和顯微操作儀。在進(jìn)行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割針，固定管要求末端鈍圓，外徑與所固定胚胎直徑相近，內(nèi)徑一般為20～30μm。切割針目前有玻璃針和微刀兩種，玻璃針一般用實(shí)心玻璃拉成，微刀是用鋒利的金屬刀片與微細(xì)玻璃棒粘在一起制成。602.胚胎預(yù)處理

為了減少切割損傷，胚胎在切割前一般用鏈霉蛋白酶進(jìn)行短時(shí)間處理，使透明帶軟化并變薄或去除透明帶。

613.胚胎分割

在進(jìn)行胚胎切割時(shí)，先將發(fā)育良好的胚胎移入含有操作液滴的培養(yǎng)皿中，操作液常用杜氏磷酸緩沖液，然后在顯微鏡下用切割針或切割刀把胚胎一分為二。62

不同階段的胚胎，切割方法略有差異：（１）桑椹胚之前的胚胎這一階段胚胎因?yàn)槁蚜亚蜉^大，直接切割對(duì)卵裂球的損傷較大。常用的方法是用微針切開透明帶，用微管吸取單個(gè)或部分卵裂球，放入另一空透明帶中，空透明帶通常來自未受精卵或退化的胚胎。（２）桑椹胚和囊胚的分割對(duì)于這一階段的胚胎，通常采用直接切割法。操作時(shí)，用微針或微刀由胚胎正上方緩慢下降，輕壓透明帶以固定胚胎，然后繼續(xù)下切，直至胚胎一分為二，再把裸露半胚移入預(yù)先準(zhǔn)備好的空透明帶中，或直接移植給受體。

634.分割胚的培養(yǎng)

為提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明帶中或者用瓊脂包埋移入中間受體在體內(nèi)或直接在體外培養(yǎng)。

645.分割胚胎的保存和移植

胚胎分割后可以直接移植給受體，也可以進(jìn)行超低溫冷凍保存。為提高冷凍胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或囊胚階段，再進(jìn)行冷凍。

65（三）胚胎分割技術(shù)的進(jìn)展

哺乳動(dòng)物的胚胎分割技術(shù)在近20年取得了較大進(jìn)展，主要表現(xiàn)為操作方法趨于簡化，效率提高。在牛的胚胎移植生產(chǎn)中，胚胎分割已用于提高胚胎移植的總受胎率和克服異性孿生不育。此外，胚胎分割取樣已用于胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因陽性胚胎的早期選擇。66應(yīng)用：1.與核移植相結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面可以培育出超純系動(dòng)物2.對(duì)小鼠、家兔、山羊等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎分割后，可以獲得同卵孿生后代3.對(duì)瀕臨滅絕的珍惜動(dòng)物也可以采用這項(xiàng)新技術(shù)進(jìn)行搶救67胚胎分割的方法（1）顯微針分割法該法適用于卵裂球階段的胚胎。操作時(shí)在顯微操作儀下將胚胎固定，用玻璃針在透明帶上作一切口，將卵裂球從透明帶中移出，并吹吸卵裂球使之離散，將其裝入2個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的空透明帶內(nèi)，進(jìn)行移植。該方法具有較高的同卵雙生率，但操作程序復(fù)雜。（2）顯微刀分割法該法適用于對(duì)桑葚胚和早期囊胚進(jìn)行分割。在顯微操作儀下固定胚胎，用特制顯微刀片將胚胎均勻一分為二，分別裝入空透明帶中，進(jìn)行移植。（3）酶軟化透明帶后顯微分割法用0.5%的鏈霉蛋白酶軟化胚胎透明帶,若是緊密化胚胎(如桑椹胚),則需在無鈣、鎂的平衡鹽溶液中處理20分鐘,使胚胎去緊密化，將胚胎固定，把將針置于欲分割的胚胎上面,使其與胚胎呈30度角,對(duì)準(zhǔn)胚胎的正中平分線徐徐下壓，即可將一個(gè)胚胎分割成兩半。（4）酶消化去透明帶后分割法用0.25%～0.5%的鏈霉蛋白酶去掉胚胎透明帶,然后用顯微玻璃針或微手術(shù)刀將裸胚一分為二。（5）徒手分割法徒手分割法主要適用于分割體積較大的胚胎，其優(yōu)勢在于可以不用顯微操作儀。在立體顯微鏡下，用止血鉗夾住切割刀片，將透明帶切開一部分，再用直徑略小于胚胎的毛細(xì)管吹吸幾次，胚胎從透明帶中脫出。手持玻璃針自上而下對(duì)稱切割裸胚。這種方法多用于分割桑椹胚和囊胚。該方法操作簡便、快速，便于生產(chǎn)應(yīng)用，但要求要有較為靈巧的操作技能。68方法：

1.用玻璃管拉成細(xì)絲，再制成切割刀，在顯微操作儀的機(jī)械手上施行分割或分散胚胎。

2.如條件較差，可徒手制成玻璃細(xì)絲，成為切割刀，在解剖鏡下徒手切割。顯微操作儀切割徒手切割69四.胚胎分割目前存在的問題

1.初生重低2.遺傳一致性不同3.同卵多胎的局限性

70歸納小結(jié)71工程之五：體外受精在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行體外受精，一般都著眼與基礎(chǔ)理論研究性質(zhì)，如為受精生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和繁殖學(xué)的基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。由于卵子和精子的受精過程是在實(shí)驗(yàn)室中完成，故通過這一技術(shù)而產(chǎn)下的動(dòng)物又稱為“試管動(dòng)物”，如“試管鼠”、“試管豬”、“試管嬰兒”等。72體外受精技術(shù)的發(fā)展簡史

動(dòng)物報(bào)道時(shí)間報(bào)道者兔小鼠大鼠人牛豬恒河猴狒狒綿羊山羊狨猴馬貓犬19591968197419781982198619841984198519851988199019701976ChangWhittinghamToyodaSteptoeBrackettChengBavisterBamaceda花田章花田章LopataZhangHammerMahi731、發(fā)展簡史

1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞學(xué)者Austin分別發(fā)現(xiàn)了精子獲能（capacitation）現(xiàn)象，使動(dòng)物體外受精研究進(jìn)入了新紀(jì)元。

1959年張明覺在世界上首先獲得了體外受精的的哺乳動(dòng)物—試管兔，推動(dòng)了體外受精研究工作的開展。

1978年首例人類試管嬰兒路易斯·布朗（LouiseBrown）誕生。74

直到20世紀(jì)80年代，動(dòng)物的體外受精技術(shù)才取得突破，尤其是牛的體外受精技術(shù)發(fā)展迅速。

1981年Brackett等用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞獲得試管牛犢，隨后Hanada等（1985）獲得綿羊和山羊體外受精后代，并于1986年獲得體外成熟卵母細(xì)胞體外受精的第一頭犢牛。我國學(xué)者盧克煥（1987）在愛爾蘭獲得全體外過程的試管牛犢。75

（1）研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)理。

（2）在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效的手段，對(duì)充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價(jià)值。

（3）在人類，IVF技術(shù)是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一。（4）體外受精技術(shù)還是哺乳動(dòng)物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分。

2、體外受精的意義763、體外受精的基本操作程序卵母細(xì)胞的體外成熟（invitromaturation,IVM）卵子和精子的體外受精（invitrofertilization,IVF）受精卵的體外培養(yǎng)（invitroculture,IVC）77(一)卵母細(xì)胞的獲取卵子來源比較困難些，需通過一定途徑才能獲得。在小動(dòng)物中，如小鼠、大鼠和地鼠等，經(jīng)過超排后可通過手術(shù)，從卵巢或輸卵管中取得，大中型動(dòng)物可通過腹腔鏡吸取卵泡中的成熟卵子或通過屠宰場獲得卵巢，從中取得成熟卵和未成熟卵，未成熟的卵可以在體外培養(yǎng)成熟。78卵母細(xì)胞一般檢測

得到卵母細(xì)胞后，可根據(jù)卵泡發(fā)育的不同時(shí)期，在顯微鏡下檢查核和胞質(zhì)發(fā)育的狀況，如核的形態(tài)、位置和所處的時(shí)期。排出的卵母細(xì)胞，有多層卵丘細(xì)胞包圍，除去卵丘細(xì)胞后，可以見到卵周隙增大，內(nèi)有第一極體，核處于第二次成熟分裂中期。多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈透明狀，但由于胞質(zhì)中富含大量脂滴和空泡，所以在鏡下呈暗色。各種不同的動(dòng)物，按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，卵的分類可以分為優(yōu)秀、普通、不良和異常卵。進(jìn)行體外受精的卵母細(xì)胞，一般以卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體外面完整地包有3－4層卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)無斑塊者為佳。79鏡檢卵母細(xì)胞

如果新鮮或固定后要作整體觀察，可以取凡士林石蠟（1：1）融化后滴于載片中部四角，在鏡下用微吸管自平皿中吸取卵母細(xì)胞，滴到4滴凡士林石蠟滴的中央，蓋上蓋片并輕壓之，即可置于相差顯微鏡下觀察。如果要觀察細(xì)節(jié)，需要染色、切片后觀察。一般在卵固定后水洗染色，用瓊脂與石蠟進(jìn)行雙重包埋，最后進(jìn)行切片、脫臘和封固，進(jìn)行觀察。80（二）、卵母細(xì)胞的選擇

采集的卵母細(xì)胞絕大部分與卵丘細(xì)胞形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）。選擇COC的要求：卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，卵母細(xì)胞不能發(fā)黑或透亮，外圍有多層卵丘細(xì)胞緊密包圍。分為四級(jí)：Ａ級(jí)卵母細(xì)胞要求有三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍，細(xì)胞質(zhì)均勻；Ｂ級(jí)要求卵母細(xì)胞質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞層低于三層或部分包圍卵母細(xì)胞；Ｃ級(jí)為沒有卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞；Ｄ級(jí)是附著蜘蛛網(wǎng)狀卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞。在體外受精實(shí)踐中，一般只培養(yǎng)Ａ級(jí)和Ｂ級(jí)卵母細(xì)胞。

一般只選擇A級(jí)和B級(jí)培養(yǎng)。81

（三）卵母細(xì)胞的體外成熟方法

由超數(shù)排卵或從排卵前卵泡中采集的卵母細(xì)胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟，可直接與精子受精；而對(duì)未成熟卵母細(xì)胞需要在體外培養(yǎng)成熟。

1.成熟培養(yǎng)液的選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)液TCM199中的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤等對(duì)卵母細(xì)胞核成熟有抑制作用的成分濃度較低，培養(yǎng)的效果相對(duì)較好。體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞還要在基礎(chǔ)液加入一定濃度的血清（5％－10％的FCS或ECS）和促性腺素（0.1－1.0μg/mlFSH和5－10μg/mlLH等）等成分。

2.成熟培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)大多數(shù)家畜來講，卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)時(shí)間一般采用22－24h，但是也要依據(jù)動(dòng)物而定。823.成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境溫度：目前，除人和嚙齒類動(dòng)物的卵母細(xì)胞體外成熟仍采用37℃外，牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38－39℃。氣象環(huán)境：CO2的濃度：應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽來定。由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為25－30mmol/L，故一般都采用5％的CO2。

4.成熟培養(yǎng)的系統(tǒng)大致可分為三大類。①開放培養(yǎng)系統(tǒng)：將1－2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平面皿內(nèi)或五孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后放入50－200枚卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，上面不覆蓋石蠟油。83

②微滴培養(yǎng)系統(tǒng)：

將成熟培養(yǎng)液先在組織培養(yǎng)皿中做成50－500μl的微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細(xì)胞置于其中培養(yǎng)。在一般情況下，這種培養(yǎng)液用在卵母細(xì)胞數(shù)量特別少的情況下采用。③密閉培養(yǎng)系統(tǒng)：

將卵母細(xì)胞置于含有1－2ml成熟培養(yǎng)液的試管中，加蓋膠塞，然后在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；如若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入一個(gè)密閉的塑料袋內(nèi)。84(四)體外受精

1.精子的獲取

精子來源比較方便，大、中型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般通過人工按摩采精或假陰道采精，都能獲得成熟的精子，小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都是通過手術(shù)，從駐精囊和輸精管內(nèi)取得成熟的精子。852.精子的分離與制備是體外受精技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)精液中的精子獲能抑制因子冷凍精液中的防凍劑和蛋黃等成分

影響和干擾受精的完成過多的留在受精液中的死精子

86①懸浮法（swimup）：是篩選高活力精子最為有效的一種方法。②玻璃棉（glasswool）過濾法：該法可有效地濾除品質(zhì)較差精液中的死精子，大提高精子的受精穿透率。

方法：精子的獲能：剛射出的精子不能穿入卵子，只有在雌性生殖道內(nèi)度過一段時(shí)間之后，才獲得受精能力的現(xiàn)象。87③BAS/哌可（Percoll）密度梯度離心法：采用不連續(xù)的BSA密度梯度可以分離得到形態(tài)正常的高活力精子。④離心洗滌法：對(duì)于精子活力較好的精液可采用直接離心洗滌法制備用于體外受精的精子。883.精子獲能原理雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)的獲能因子中和精子表面的去能因子精子質(zhì)膜的膽固醇外流Ca2+進(jìn)入精子內(nèi)部膜的通透性增加獲能完成

膜蛋白重新分布，膜的穩(wěn)定性下降cAMP濃度升高激活腺苷酸環(huán)化酶抑制磷酸二酯酶89

目前精子的獲能處理方法主要有：

①與血清白蛋白的溶液長時(shí)間孵育：原理是血清中白蛋白具有很強(qiáng)結(jié)合膽固醇和鋅離子的能力，可除去質(zhì)膜中部分膽固醇和鋅離子，改變精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子獲能。②用高離子強(qiáng)度溶液處理精子：精子表面的去能因子（被膜蛋白），當(dāng)用高離子強(qiáng)度溶液處理精子時(shí)，將從精子的表面脫落，從而導(dǎo)致精子獲能。③與含有卵泡液的培養(yǎng)液進(jìn)行孵育：在培養(yǎng)液中添加一定濃度的卵泡液將有可能誘發(fā)精子獲能。90④使用鈣離子載體A23187：

直接誘發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而導(dǎo)致精子獲能。⑤使用肝素：是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，當(dāng)它與精子結(jié)合后，能引起Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子的獲能。是一種接近于體內(nèi)獲能的生理性方法，已經(jīng)成為動(dòng)物體外受精應(yīng)用最廣的一種精子獲能方法。91精子入卵的三道屏障：擴(kuò)展的卵丘透明帶卵質(zhì)膜弱精、畸精、少精癥患者的精子很難穿越三道屏障92人為使得精子獲能可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。而雌性生殖道獲能沒有種屬特異性，因而可以由屠宰場取任何的動(dòng)物的子宮或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取小動(dòng)物的子宮給所需動(dòng)物的精子獲能。另外，可以利用人工配制的培養(yǎng)液使得精子獲能。93（3）.受精

獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵子，一般情況下在