復(fù)發(fā)性單純皰疹性角膜基質(zhì)炎的動物模型的建立

復(fù)發(fā)性單純皰疹性角膜基質(zhì)炎的動物模型的建立

單帶流行性疾?。╥型h-vius，1）是由感染膜感染的單次性膜生動物（hsk）引起的單次性膜生動物化學(xué)克林氏感染的疾病。這是由cd4和t細胞誘導(dǎo)的免疫炎。為了進一步研究CD4+T細胞的兩種亞型——Th1細胞和Th2細胞在HSK免疫病理過程中所起的作用,我們制備了復(fù)發(fā)性HSK的BALB/c鼠的模型,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)檢測Th1細胞和Th2細胞分泌的細胞因子在鼠的角膜組織中的表達水平,并探討細胞因子的表達與復(fù)發(fā)性HSK之間的關(guān)系。材料和方法一、動物模型的制備1.空斑單位的使用病毒為隔離的人的高神經(jīng)毒力的單純皰疹病毒Ⅰ型(herpessimplexvirustype1,HSV-1)Mckrae毒株(美國華盛頓大學(xué)眼科中心提供),使用前滴度為2.2×1012空斑單位(plagueformingunit,PFU)/L。生產(chǎn)和檢測病毒的細胞為非洲綠猴腎細胞(Africangreenmonkeykidney,VERO)。培養(yǎng)VERO細胞的營養(yǎng)液為含5%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(0.1g/L)改進的最小基礎(chǔ)培養(yǎng)基(dulbecco′smodifiedeaglemedium,DMEM,美國Gibco公司提供)。2.病毒在右眼角膜上的感染途徑(1)動物:選用鼠齡4～6周、體重18～21g的雌性BALB/c小鼠(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗室提供)180只作為實驗對象,采用隨機數(shù)表方法將其分為兩組,每組90只。實驗組:角膜接種HSV-1。對照組:角膜不接種病毒。(2)方法:實驗組鼠麻醉后置于顯微鏡下,用無菌手術(shù)尖刀片交叉劃傷右眼角膜上皮層呈“#”字形;將5μl含有1×106PFU病毒的DMEM滴于右眼角膜表面,輕輕按摩鼠的眼瞼;同時向鼠的腹腔內(nèi)注射人的抗病毒血清1ml(美國Chemicon公司產(chǎn)品,該血清中和HSV-1的半數(shù)有效劑量為1/640),使病毒潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)而角膜恢復(fù)光滑透明,限制病毒擴散使鼠100%存活。對照組鼠的右眼角膜劃傷后滴5μl不含病毒的DMEM。3d后,用蘸有DMEM的濕棉簽擦拭右眼角膜表面的淚液膜并將其放入裝有1mlDMEM的試管中,用VERO細胞培養(yǎng)的方法檢測擦拭液中有無病毒存在;并于接種后第3天和1周時,在裂隙燈顯微鏡下檢查角膜情況。除外無樹枝狀、地圖狀角膜炎或淚液膜中未檢測出病毒的鼠,余鼠繼續(xù)養(yǎng)育6周,使急性上皮性角膜炎愈合并使病毒在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)建立起潛伏感染。在此期間,每周用裂隙燈顯微鏡檢查角膜1次,觀察病毒有無自發(fā)性復(fù)發(fā)。7周時,采用隨機數(shù)表方法抽取實驗組10只小鼠,取接種側(cè)角膜表面淚液膜及三叉神經(jīng)節(jié)檢測病毒,證實潛伏感染已建立。3.b.細胞菌群7周時,將處于病毒潛伏期且角膜恢復(fù)光滑透明的70只實驗組小鼠和70只對照組小鼠麻醉后,用紫外線B光照射鼠的右眼角膜,激活潛伏感染的病毒。紫外線B光光源為TW20Chromato-Vutransilluminator(美國UVP公司產(chǎn)品),其光波波長為302nm,每只鼠的右眼接受170mJ/cm2紫外線。于紫外線照射角膜的當(dāng)天及照射后的7d內(nèi),每天1次用蘸有DMEM的濕棉簽擦拭右角膜表面淚液膜,并將擦拭液用VERO細胞培養(yǎng),檢測單純皰疹病毒,判定病毒是否復(fù)發(fā)。4.視網(wǎng)膜及新生血管接射線特征紫外線照射角膜后的第1～10、14、21及28天,每天1次用裂隙燈顯微鏡檢查角膜改變。(1)評估角膜基質(zhì)炎的標(biāo)準(zhǔn)(0～4分):0分,角膜基質(zhì)清晰透明;1分,角膜基質(zhì)稍混濁;2分,角膜基質(zhì)中度混濁,可透見后部虹膜特征;3分,角膜基質(zhì)重度混濁,但仍可判斷瞳孔緣的位置;4分,角膜基質(zhì)完全混濁,失去后部特征。(2)評估角膜新生血管化的標(biāo)準(zhǔn)(0～2分):0分,無新生血管長入角膜;1分,新生血管向心性生長,但未達到瞳孔中央或未超過角膜半徑;2分,新生血管達到瞳孔中央或超過角膜半徑。5.hsk復(fù)發(fā)性疾病的組織病理學(xué)檢查紫外線照射角膜后的第28天,取鼠右眼球,用10%甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。二、半定量rt-pcr方法用于檢測遺傳因子的表達1.大鼠視網(wǎng)膜下環(huán)參數(shù)法分別于紫外線照射前(0d),照射后第3、7、10、14、21及28天,在無菌條件下用環(huán)鉆微型切割器于角膜中央切取直徑2mm的角膜環(huán),每個時間點取6只實驗組鼠的角膜和6只對照組鼠的角膜,放入無菌試管中,于-70℃冰箱內(nèi)保存。2.總rna提取取角膜標(biāo)本放入試管中置于冰上,剪碎、研磨,加1mlRNA提取液(TRIzol-Reagent,大連寶生物工程有限公司提供),用5ml注射器抽吸10次成乳狀。用氯仿、異丙醇、酒精等處理提取總RNA。所得樣品RNA于-70℃冰箱內(nèi)保存。紫外分光光度儀測吸光度A260/A280值,利用A260計算RNA濃度,并稀釋至1g/L。3.逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈互補dna應(yīng)用KATARABiotechnolgy試劑盒(大連寶生物工程有限公司)做cDNA合成。4.pcr擴增系統(tǒng)PCR反應(yīng)體系25μl,包含模板(第1鏈cDNA)3μl,2.5mmol/LdNTP2μl,5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl,10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl,β-actin上、下游引物各0.5μl,IFN-γ或IL-4或IL-6或IL-10或IL-12上、下游引物各0.6μl,雙蒸水15.1μl,在美國產(chǎn)PTC-100TM型PCR擴增儀上擴增35個循環(huán),94℃預(yù)變性3min;94℃變性45s,59.5℃退火60s(IFN-γ:59.5℃;IL-4:53.5℃;IL-10:54.5℃;IL-12p40:53℃),72℃延伸90s,最后1次反應(yīng)72℃延伸7min。引物(由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)的核苷酸序列和擴增產(chǎn)物大小見表1。5.細胞因子mrna表達量的測定取擴增產(chǎn)物5μl,在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,溴化乙錠染色,紫外線燈下觀察電泳帶并拍照,經(jīng)Kodak-1D型凝膠成像系統(tǒng)(美國EastmanKodak公司)輸入計算機,用MolecularAnalyst(version1.4.1)軟件對泳帶進行吸光度(A)值測定,所得數(shù)值代表細胞因子mRNA及β-actinmRNA的絕對表達量,以二者的比值(N值)代表細胞因子mRNA的相對表達量。三、不同處理條件對鼠視網(wǎng)膜細胞因子的影響各種細胞因子mRNA的數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實驗組小鼠受紫外線照射后不同時間點角膜表達的細胞因子水平與照射前比較采用t檢驗;實驗組與對照組小鼠受紫外線照射后不同時間點角膜表達細胞因子水平的比較也采用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果一、復(fù)發(fā)性視網(wǎng)膜感染的臨床表現(xiàn)BALB/c鼠的角膜接種HSV-1后第3天的角膜表面淚液膜中檢測出HSV-1復(fù)制,所有鼠均患急性上皮性角膜炎。角膜接種HSV-1后第7周時,抽樣10只小鼠檢測HSV-1結(jié)果為角膜表面淚液膜內(nèi)陰性,而三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)陽性,證實小鼠處于病毒潛伏感染狀態(tài)。處于病毒潛伏感染期的鼠和對照組的鼠接受了相同劑量的紫外線照射后,對照組鼠僅表現(xiàn)為輕微的角膜水腫及一過性角膜新生血管化,很快恢復(fù)正常,淚液膜內(nèi)未檢測到病毒。實驗組78.6%(55/70)鼠的淚液膜內(nèi)檢測到病毒復(fù)制,即病毒的復(fù)發(fā)率為78.6%;復(fù)發(fā)性角膜感染主要表現(xiàn)為角膜基質(zhì)炎,裂隙燈顯微鏡下可見角膜基質(zhì)混濁及角膜新生血管化。組織學(xué)檢查可見角膜上皮層完整,基質(zhì)內(nèi)有大量的炎性細胞浸潤,主要為淋巴細胞、巨噬細胞及中性粒細胞,有的前房內(nèi)可見大量炎性細胞滲出。紫外線照射后不同時間的平均角膜混濁程度(圖1)和平均角膜新生血管化程度(圖2)顯示:角膜基質(zhì)混濁于紫外線照射后第3天開始出現(xiàn),7～14d為角膜基質(zhì)混濁的高峰時間,14d后角膜基質(zhì)混濁逐漸下降,處于恢復(fù)期;角膜新生血管化于紫外線照射后第3天開始出現(xiàn),并且迅速加重,第7～28天為角膜新生血管化嚴重的時間。二、mrna的表達處于病毒潛伏感染期的小鼠(實驗組)和未感染病毒的小鼠(對照組)接受相同劑量的紫外線照射后,細胞因子在角膜組織的表達結(jié)果見圖3。潛伏感染期的小鼠(條帶8～14)經(jīng)紫外線照射后,IFN-γ、IL-12、IL-10和IL-4mRNA在角膜組織中均有表達。其中,IFN-γmRNA在臨床疾病出現(xiàn)前和疾病發(fā)展過程中(病毒激活后3～14d)高表達,在疾病恢復(fù)期(14d后)表達減弱;IL-10mRNA在病毒激活后的第3天開始表達于角膜組織,表達的高峰時間為第7～14天,14d后表達逐漸減弱,以稍低的表達水平平行于IFN-γ的表達;IL-4mRNA在病毒激活后的第3～14天有明顯表達,14d后表達迅速下降,幾乎接近于病毒激活前的水平;IL-12mRNA是角膜組織內(nèi)表達最豐富的細胞因子,在病毒激活后的第3天即開始高表達,高表達持續(xù)經(jīng)過整個觀察期,其表達趨勢平行于臨床觀察到的角膜新生血管化曲線(表2)。對照組小鼠角膜(條帶1～7)經(jīng)紫外線照射后,IFN-γ和IL-4mRNA無表達;IL-12mRNA有明顯的表達(第3～14天),但表達水平明顯低于實驗組(P<0.01);IL-10mRNA有微弱表達(第7～10天),表達水平明顯低于實驗組(P<0.01,表3)。討論一、hsv-1和hsk感染的檢測制備復(fù)發(fā)性HSK的實驗?zāi)Ｐ?首先要建立起HSV-1潛伏感染的模型,然后用特定的條件或因素來誘導(dǎo)復(fù)發(fā)。我們選用BALB/c鼠,經(jīng)角膜接種HSV-1后,HSV-1在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)成功地建立起潛伏感染,潛伏感染階段為原發(fā)感染后的2～6周。病毒接種后第7周時,隨機抽樣10只小鼠,檢測HSV-1結(jié)果為角膜表面淚液膜內(nèi)陰性,而三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)陽性,證實小鼠處于病毒潛伏感染狀態(tài)。用紫外線B光照射鼠的角膜誘導(dǎo)HSK復(fù)發(fā)。本研究結(jié)果顯示:HSK的復(fù)發(fā)率為78.6%;復(fù)發(fā)性HSK主要表現(xiàn)為角膜基質(zhì)混濁,基質(zhì)層內(nèi)有大量的炎性細胞浸潤,角膜新生血管化,與人類復(fù)發(fā)性單純皰疹性角膜炎的表現(xiàn)非常相似。二、hsk初感染模型的建立單純皰疹性角膜基質(zhì)炎是一種由CD4+T細胞介導(dǎo)的免疫病理性疾病。為了進一步探討CD4+T細胞的兩種亞型——Th1細胞和Th2細胞在HSK發(fā)病過程中所起的作用,研究者經(jīng)常采用兩種方法進行研究:一是檢測感染的角膜組織上表達的細胞因子;二是觀察外源性細胞因子及細胞因子抗體的使用對HSK疾病程度的影響。既往學(xué)者采用鼠的原發(fā)性感染模型進行研究,發(fā)現(xiàn)細胞因子的類型隨著疾病的進展發(fā)生著相應(yīng)的改變。例如Th1型細胞因子(IFN-γ和IL-2)在疾病的早期表達,與HSK惡化的炎性反應(yīng)有關(guān),Th2型細胞因子(IL-10和IL-4)在疾病的晚期表達,與損傷的修復(fù)及保護性抗體反應(yīng)有關(guān)。然而最近的研究卻顯示IL-2和IL-12對HSK具有高度保護作用,與既往研究的結(jié)果相矛盾,并且這些由原發(fā)性感染模型得到的結(jié)果無法直接推測到人類復(fù)發(fā)性病毒性角膜炎中來。因此,本研究采用復(fù)發(fā)性感染模型,檢測在HSK復(fù)發(fā)過程中角膜組織表達的細胞因子類型,探討細胞因子的表達與疾病程度之間的關(guān)系,為HSK的免疫學(xué)治療提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示:在HSK復(fù)發(fā)的早期,Th1型細胞因子(IFN-γ)和Th2型細胞因子(IL-10、IL-4)同時表達于角膜組織中。其中,IFN-γ和IL-10在角膜基質(zhì)混濁的發(fā)生、發(fā)展過程中呈高表達,在角膜基質(zhì)混濁減輕即疾病恢復(fù)過程中呈低表達,即IFN-γ和IL-10的表達水平與HSK的疾病程度密切相關(guān),提示Th1型細胞因子反應(yīng)和Th2型細胞因子反應(yīng)可能均有助于小鼠抵御單純皰疹病毒的復(fù)發(fā)感染。此結(jié)論與Cantin等的研究結(jié)果一致。Cantin等采用IFN-γ基因敲除鼠和IFN-γ受體基因敲除鼠,建立潛伏感染模型,然后用高熱誘導(dǎo)病毒激活,發(fā)現(xiàn)盡管IFN-γ不涉及病毒激活的誘導(dǎo),但是病毒一旦被激活,IFN-γ能迅速增加、抑制病毒的復(fù)制。在以往的研究中,我們將外源性重組IL-10注射到小鼠角膜組織中,發(fā)現(xiàn)IL-10能有效地抑制復(fù)發(fā)性HSK的發(fā)展。IL-12是單核細胞、B細胞、多形核白細胞的產(chǎn)物,能誘導(dǎo)Th1型細胞反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示:IL-12在紫外線照射潛伏感染期小鼠角膜后的第3天即迅速增加,并且保持高表達經(jīng)過整個觀察期。盡管對照組鼠于紫外線照射后的第3～14天角膜組織也表達IL-12,但與實驗組比較表達量相對較低且表達時間短。因此,我們認為雖然紫外線照射也能誘導(dǎo)正常角膜組織表達某些細胞因子,但是IL-12在復(fù)發(fā)性HSK鼠的角膜組織中高表達與HSK的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。至于IL-12在HSK復(fù)發(fā)過程中的作用,尚待進一步探討。三、hsk細胞因子與th1和th2細胞增殖相關(guān)實驗初發(fā)性基因子的關(guān)系IL-4和IL-10為Th2型細胞因子。在小鼠原發(fā)性感染模型中,IL-4和IL-10在疾病的后期(急性感染后第21天)才有表達,因此,被認為與疾病的修復(fù)和控制炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究中,IL-4和IL-10在疾病早期(病毒被激活后的第3天)就有表達,考慮與T細胞的免疫記憶性有關(guān)。在HSV-1原發(fā)感染階段,幼稚性T細胞受病毒抗原刺激后分化、增殖為效應(yīng)性CD+4Th1細胞和Th2細胞;這些細胞在