熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)具體步驟及詳細(xì)說(shuō)明

熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)具體環(huán)節(jié)及具體闡明用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而能夠探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。1.

探針變性將探針在75℃恒溫水浴中溫育5min，立刻置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。2.

標(biāo)本變性（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2xSSC的變性液中變性2～3min。

（3）立刻按次序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。3.

雜交將已變性或預(yù)退火的DNA探針10uL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18x18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過(guò)夜（約15～17h）。由于雜交液較少，并且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。4.

洗脫此環(huán)節(jié)有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而減少本底。（1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2xSSC中洗滌3次，每次5min。

（3）在已預(yù)熱42～50℃的1xSSC中洗滌3次，每次5min。

（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本于2xSSC中輕洗一下。

（5）取出玻片，自然干燥。

（6）取200uL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。5.

雜交信號(hào)的放大（合用于使用生物素標(biāo)記的探針）（1）在玻片的雜交部位加150uL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2）去掉保鮮膜，再加150uLavidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。

（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150uL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。（5）去掉保鮮膜，加150uLantiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

（6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

（7）重復(fù)環(huán)節(jié)（1）、（2）、（3），再于2xSSC中室溫清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200uLPI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。6.

封片可采用不同類(lèi)型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為避免蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周邊封閉。封好的玻片標(biāo)本能夠在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。7.

熒光顯微鏡觀察FISH成果先在可見(jiàn)光源下找到含有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開(kāi)熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)及濾光鏡選擇注意事項(xiàng)有關(guān)溶液的配制1.20×SSC：175.3gNaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.0）。2.去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹(shù)脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatmanl號(hào)濾紙濾。3.體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL20×SSC，10mL水。4.體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL20×SSC，80mL水。5.體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。6.雜交液：8μL體積分?jǐn)?shù)25%DS，20μL20×SSC混合。（或40μL體積分?jǐn)?shù)50%DS，20μL20×SSC，40μLddH2O混合）取上述混合液50μL，與5μLDF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10%DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50%DF。7.PI/antifade溶液PI原液：先以雙蒸水配備溶液，濃度為100μg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充足混勻，——20℃保存?zhèn)溆谩?.DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mgDAPI儲(chǔ)存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。9.封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5%BSA3mL，20×SSC1mL，ddH2O1mL，Tween205μL混合。10.封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5%

BSA3mL，20×SSC1mL，goatserum250μL，ddH2O750μL，Tween205μL混合。11.熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5%

BSA1mL，20×SSC1mL，ddH2O3mL，Tween205μL混合。12.洗脫液：100mL20×SSC，加水至500mL，加Tween20500μL。有關(guān)溶液的配制1.20×SSC：175.3gNaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.0）。2.去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹(shù)脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatmanl號(hào)濾紙濾。3.體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL20×SSC，10mL水。4.體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL20×SSC，80mL水。5.體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。6.雜交液：8μL體積分?jǐn)?shù)25%DS，20μL20×SSC混合。（或40μL體積分?jǐn)?shù)50%DS，20μL20×SSC，40μLddH2O混合）取上述混合液50μL，與5μLDF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10%DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50%DF。7.PI/antifade溶液PI原液：先以雙蒸水配備溶液，濃度為100μg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充足混勻，——20℃保存?zhèn)溆谩?.DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mgDAPI儲(chǔ)存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。9.封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5%BSA3mL，20×SSC1mL，ddH2O1mL，Tween205μL混合。10.封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5%

BSA3mL，20×SSC1mL，goatserum250μL，ddH2O750μL，Tween205μL混合。11.熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5%

BSA1mL，20×SSC1mL，ddH2O3mL，Tween205μL混合。12.洗脫液：100mL20×SSC，加水至500mL，加Tween20500μL。熒光原位雜交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一門(mén)新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80